Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na preparação do Gálio 68 rotulado RGD-Peptídeo e o método para a avaliação biológica de seus análogos. A principal vantagem dessa técnica é que é um protocolo sistêmico simples para o desenvolvimento de um novo peptídeo rotulado por radiometal. Demonstrando o procedimento será Ki-Hye Jung, um pós-doutor do nosso instituto.
Comece usando ácido clorídrico molar de 0,5 molar para elute radiolabeled gálio triloreto de um gerador de gálio radiolabeled. Purgue o composto em frasco de reação de cinco mililitros com gás nitrogênio a 80 graus Celsius. Seguido pela adição de 100 microgramas de acetato de glicina de arginina ou peptídeo RGD em um acetato de sódio molar ao composto seco.
Aqueça a mistura de reação a 80 graus Celsius durante cinco minutos antes de permitir que a mistura esfrie à temperatura ambiente. Para purificar o produto bruto com cromatografia líquida de alto desempenho, adicione a solução a uma coluna C18 e passe a solução através de um cartucho em faseversa C18. Lave o cartucho com dois mililitros de soro fisiológico e elute o peptídeo radiolabeled com 0,7 mililitros de 95% de etanol seguido pela remoção do solvente a 80 graus Celsius sob gás nitrogênio por 20 minutos.
Reconstitua o peptídeo purificado em PBS e filtre o produto radiolabeled através de um coador estéril estéril de 0,22 mícrons. Formule o peptídeo em um mililitro de solução salina estéril e localmente um microliter de solução de peptídeo em uma placa de cromatografia de camada fina instantânea. Em seguida, desenvolva a placa na câmara contendo ácido cítrico molar aquoso 0,1 até nove centímetros de distância do local para determinar o rendimento químico de rádio.
Para avaliar a absorção celular in vivo do peptídeo, trate uma vez 10 a sexta células de glioblastoma humano por poço em seis placas de poço com 111 kilobecquerel de RGD-peptídeo radiolabeled por poço a 37 graus Celsius por 30, 60, 90 ou 120 minutos em triplicado. Ao final da incubação, lave os poços duas vezes com dois mililitros de PBS por lavagem, e colme as células com 0,25% Trypsin e 0,02% EDTA em PBS a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, transfira as células de cada poço em tubos cônicos de 15 mililitros para medir a absorção de peptídeos radiolabeled em um contador gama.
Para avaliar a estabilidade sárida do peptídeo RGD radiola rotulado, adicione 500 microliters de soro de rato recém-preparado, 500 microliters de soro humano e 500 microliters de PBS a 50 microliters de cada amostra e incubar as misturas a 37 graus Celsius por até duas horas. Em seguida, localize de um a dois microlitadores de cada amostra em uma placa de cromatografia de camada fina instantânea após 30, 60, 90 e 120 minutos de incubação e desenvolva as placas como demonstrado. Para determinar a lipoficidade do peptídeo, adicione 10 microliters do peptídeo RGD radiola rotulado a um sistema pbs octanal e misture os frascos generosamente por cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, colete o peptídeo por centrifugação e colide 100 microliters de amostra de cada camada para medir com um contador gama. Para gerar modelos tumorais radiolabeled, carregue cinco vezes 10 a sexta células humanas de glioblastoma em 100 microliters de PBS em uma seringa de insulina de meia polegada equipada com uma agulha de 28 bitola por rato nu BALB/c a ser injetada, e entregue as células tumorais subcutâneamente no flanco esquerdo de cada destinatário. Para quantificação in vivo do peptídeo por tomografia de emissão de pósitrons, ou PET, coloque a cabeça um rato com rolamento de tumor, anestesiado no pórtico PET e administre intravenosamente 7,4 megabecquerels de solução de RGD-peptídeo radiolabeled em 200 microliters de PBS em cada modelo de rato de xenoenxerto através da veia traseira ao longo de um minuto enquanto realiza uma varredura PET no modo de lista.
Para análise de biodistribução ex vivo, injete 0,37 megabecquerels de RGD-peptídeo radiolabeled em 200 microliters de PBS na veia traseira de um animal xenergrafado, portador de tumor, e colher os tecidos de interesse aos 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção. Em seguida, pese os tecidos e meça sua radioatividade com um contador gama. Após a quelação, as impurezas de reação podem ser removidas com sucesso por cromatografia líquida de alto desempenho, como demonstrado.
Uma pureza radioquímica superior a 99% do peptídeo RGD radiolabeled pode ser alcançada com uma atividade específica no final da síntese entre 90 e 130 megabecquerels por nanômetro. A análise pet demonstra uma alta absorção inicial nos órgãos principais, incluindo fígado, rim, coração, músculo, bem como dentro do tumor. Durante os estágios posteriores de análise, a região tumoral pode ser claramente visualizada com a relação tumoral/músculo permanecendo inalterada, indicando a estabilidade cinética do peptídeo.
A análise de biodistribução ex vivo revela que a radioatividade acumulada no tumor diminui ao longo do tempo, como esperado dos achados in vivo PET. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, embora nossa metodologia não possa substituir o delicado processo de avaliação biológica, ele pode ser usado para ser consideravelmente utilizado o tempo e o custo de uma prática tradicional de desenvolvimento de medicamentos. Não se esqueça que trabalhar com os materiais radioativos pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso do equipamento de proteção adequado, como um dosímetro pessoal e dosímetro termoluminescente, deve ser sempre tomado durante a realização desses procedimentos.
