⁶⁸Ga 標識アルギニン グリシン アスパラギン酸 (RGD) の準備-血管新生のためのペプチッド

この方法は、RgDペプチドとラベル付けされたガリウム68の調製における主要な質問とその類似体の生物学的評価方法に答える助けとなります。この技術の主な利点は、新しい放射性金属標識ペプチドの開発のための単純な全身プロトコルであるということです。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究所のポストドクターであるKi-Hye Jungです。

放射性標識ガリウムゲルマニウム発生器から三塩化ガリウムの放射状を溶出するために0.5モル塩酸を使用することから始めます。80°Cの窒素ガスで5ミリリットル反応バイアルで化合物をパージします。その後、1つの酢酸ナトリウムモルに100マイクログラムのアルギニン酢酸またはRGDペプチドを添加した。

反応混合物を摂氏80度で5分間加熱してから室温まで冷却します。高品質の液体クロマトグラフィーで粗製品を精製するには、C18カラムに溶液を加え、C18逆相カートリッジを通して溶液を通過させます。カートリッジを2ミリリットルの生理食塩水で洗い、放射性標識ペプチドを0.7ミリリットルの95%エタノールで溶出し、窒素ガス下で80°Cで溶媒を20分間除去します。

精製したペプチドをPBSで再構成し、無菌0.22ミクロンの滅菌ストレーナーを介して放射性標識生成物を濾過する。滅菌生理食塩水の1ミリリットルにペプチドを配合し、瞬時の薄層クロマトグラフィープレート上に1マイクロリットルのペプチド溶液をスポットします。次に、水性0.1モルクエン酸を含むチャンバー内のプレートを、その場所から9センチメートル離れるまで展開し、無線化学収率を決定する。

インビボ細胞の取り込み量を評価するには、30、60、90または120分の摂氏37度で111キロベクレルの放射性標識RGDペプチドを有する6つのウェルプレートで、10〜6番目のヒト神経膠芽腫細胞を1回治療する。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき2ミリリットルのPBSで井戸を2回洗浄し、37°CでPBSで0.25%トリプシンと0.02%EDTAで3〜5分間細胞を収穫します。次に、各ウェルから15ミリリットルの円錐管に細胞を移し、ガンマカウンター上の放射性標識ペプチド取り込み量を測定する。

放射性標識されたRGDペプチドの血清安定性を評価するには、調製した新しいマウス血清500マイクロリットル、ヒト血清500マイクロリットル、PBS500マイクロリットルを各サンプルの50マイクロリットルから50マイクロリットルに加え、37°Cで最大2時間培養します。次に、30分、60分、90分、120分後に各サンプルの1~2マイクロリットルを瞬時に薄い層クロマトグラフィープレートに置き、実証したようにプレートを開発します。ペプチドの親油性を決定するには、8月のPBSシステムに10マイクロリットルの放射性標識RGDペプチドを加え、バイアルを室温で5分間寛大に混合します。

次いで、ガンマカウンターで測定するために各層から100マイクロリットルのサンプルを遠心分離して収穫することによりペプチドを回収する。放射性標識腫瘍モデルを生成するには、PBSの100マイクロリットルの6番目のヒト神経膠芽腫細胞に10回10回を注入するBALB/cヌードマウスあたり28ゲージ針を装備した10インチのインスリン注射器にロードし、腫瘍細胞を各レシピエントの左脇腹に皮下に送達する。陽電子放出断層撮影(PET)によるペプチドのインビボ定量化については、頭部を腫瘍軸受け、麻酔薬マウスをPETガントリーに入れ、PBSの200マイクロリットルの放射性標識RGDペプチド溶液の7.4メガベクレルを各異種マウス移植片モデルに1分間にわたって静脈内投与する。

ex vivoバイオディストリビューション解析では、PBSの200マイクロリットルに放射標識されたRGDペプチドの0.37メガベクレルを異種移植された腫瘍を持つ動物の尾静脈に注入し、注射後30分、60分、90分、120分で目的の組織を収穫する。次に、組織を計量し、ガンマカウンターでそれらの放射能を測定します。キレート化後、反応不純物は、実証したように高速液体クロマトグラフィーにより正常に除去することができる。

放射標識されたRGDペプチドの99%以上の放射性化学的純度は、ナノメートル当たり90〜130メガベクレルの間の合成の終わりに特定の活性を得ることができます。PET分析は、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、ならびに腫瘍内を含む主要臓器における最初の高い取り込みであることを示す。分析の後期段階では、腫瘍領域を変化しないままの筋肉比に腫瘍を明確に可視化することができ、ペプチドの運動安定性を示す。

Ex vivoバイオディストリビューション分析は、in vivo PETの知見から期待されるように、腫瘍内の蓄積された放射能が時間の経過とともに減少することを明らかにした。この手順を試みる一方で、我々の方法論は繊細な生物学的評価プロセスに取って代わることはできませんが、従来の医薬品開発慣行の時間とコストをかなり使用できることを覚えておくことが重要です。放射性物質の使用は非常に危険であり、個人の放射線量計や温度発光量計のような適切な保護具を使用するなどの予防措置は、これらの手順を実行する際に常に取られるべきであることを忘れないでください。