La terapia génica ex vivo y el trasplante de células autólogias para el tratamiento de errores innatos del metabolismo en el hígado es una alternativa importante a la terapia para estos trastornos. Y nos permite no sólo tratar estos trastornos, sino descubrir la biomasa necesaria para poder lograr un resultado terapéutico. Este enfoque también evita las consecuencias significativas de la inmunosupresión y otras consecuencias con diferentes tipos de terapias.
En el contexto actual, estamos usando este enfoque para tratar la tirosinemia hereditaria tipo 1. Sin embargo, la idea es que este será un enfoque de plataforma para tratar una multitud de diferentes enfermedades hepáticas con mínima alteración. Es importante poder visualizar esta técnica porque hay cierta variabilidad a la hora de visualizar la eficiencia de la perfusión, que es esencial para obtener hepatocitos viables para el trasplante.
Procedimiento quirúrgico realizado por Robert Kaiser y Joseph Lillegard. Aislamiento celular realizado por Zeji Du, Bruce Amiot. La purificación celular de UAU y la transducción ex vivo de las células fue realizada por Caitlin VanLith.
La preparación de los animales y la preparación del quirófano fue hecha por Kari Allen y Laurie Hillin. Para realizar la entrada inicial del sitio portuario, realice una técnica abierta de Hasson cephalad al umbilicus de un cerdo de granja anesthetizado, de hasta tres meses de edad, grande y blanco. Introduciendo un trocar de 12 milímetros en la cavidad abdominal, donde el peritoneo es visible.
Cuando el trocar está en su lugar, pasar un alcance de 5 milímetros 30 grados a través del puerto de entrada e insuflar el abdomen con dióxido de carbono a 15 milímetros de mercurio. Bajo visualización directa con la cámara laparoscópica, coloque 2 puertos adicionales de 5 milímetros, triangulando en el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Y coloque el laparoscopio en uno de los nuevos puertos.
Identifique el segmento lateral izquierdo del hígado en el punto de la fisura principal del lóbulo izquierdo que separa los segmentos laterales medios e izquierdos. Y usa una grapadora quirúrgica para asegurar las estructuras vasculares y la vena hepática a lo largo de esta fisura. Transecte el parénquima a través de esta fisura usando disparos secuenciales y cargas vasculares de 60, 45 o 30 milímetros de largo.
Cuando la resección esté completa, evalúe el hígado remanente para asegurar una hemostasia adecuada y use pinzas endoscópicas y una bolsa de recuperación de tejido endoscópico para recuperar la sección hepática. Ahora, quite los puertos y utilice una sutura de tamaño cero interrumpida para la fascia de línea media. Una sutura 2-0 para la capa dérmica profunda.
Y una sutura 4-0 para la capa subcuticular, para cerrar la incisión de puerto de 12 milímetros en las tres capas. A continuación, cierre los puertos de cinco milímetros en una capa con 2-0 suturas. Y coloca un apósito estéril en las incisiones.
Para el aislamiento de hepatocitos, conecte primero un conjunto de bombas peristálticas para entregar las soluciones de dispersión, mantenidas en un baño de agua celsius de 43 grados, a los catéteres que se colocarán en los vasos grandes expuestos de la sección hepática. Preparar la bomba y el tubo con la perfusión dos solución, hasta una posición de la polla de parada para cambiar entre la perfusión uno y la perfusión de dos solución de entrega al tejido. Y cambie la polla de parada a la perfusión una posición.
A continuación, prepara el resto del conjunto de tubos. Llenar completamente una trampa de burbujas en línea para evitar la introducción de burbujas de aire en el tejido. A continuación, haga una incisión transversal limpia, perpendicular a la circulación hepática para revelar secciones transversales de las ramas de la vena porta y las venas hepáticas para el cateterismo.
Y usa un catéter de ajuste perfecto para cateterizar las venas expuestas disponibles. Cuando los catéteres estén en su lugar, perfume el tejido hepático resecado con perfusión caliente una solución a un caudal de 100 milímetros por minuto. Mover el tubo de salida de vena a vena cada 30 a 60 segundos.
Y usando un tubo de evacuación para eliminar el exceso de tampón de la bandeja de tejido. Después de recorrer todas las venas disponibles durante 15 a 20 minutos, cambie a la perfusión de dos soluciones en las mismas condiciones. Usando una bomba de retorno para reciclar la perfusión dos solución de nuevo al depósito, a un caudal más lento, para su re-administración en el tejido.
Compruebe la temperatura superficial de la trampa de burbujas y, o el hígado aproximadamente cada cinco minutos para confirmar que los hepatocitos no se están enfriando. Cuando el hígado se blanquee después de unos 30 minutos de perfusión, transfiera el tejido a un recipiente estéril, envuelto con un drap estéril, y coloque el recipiente en una capucha de cultivo celular para mantener la esterilidad durante el procesamiento de hepatocitos. El aislamiento de la colagenasa de los hepatocitos y la desasociación celular debe hacerse completamente para que no se agrupe de las células, lo que disminuye la viabilidad de las células y la frecuencia de transducción.
Sumerja el hígado con el medio de lavado de hepatocitos y arrastre las tijeras a través de la parte superior del tejido para interrumpir la cápsula hepática. Usando guantes estériles, masajee suavemente el hígado para liberar los hepatocitos en el medio. Y filtrar el sobrenadante de tejido, a través de gasa estéril, en botellas de centrífugas de 200 mililitros.
Recoger los hepatocitos filtrados por centrifugación. Agrupación de las células en 150 mililitros de hepatocito fresco medio de lavado en una sola botella de 200 mililitros para 2 lavados adicionales. Y contando las células después de la tercera centrifugación.
Luego, diluir las células a 1 por 10 a la novena concentración de hepatocitos por mililitro de solución salina. Para la autotrasplanación de los hepatocitos aislados, utilice un transductor de dos-cinco megahercios para identificar la vena porta a través de ultrasonido y dirigir una aguja de cinco pulgadas de calibre 18 hacia la vena porta principal, aproximadamente a su bifurcación. Cargue las células en una jeringa de 60 mililitros, de acuerdo con el volumen total de la célula y conecte la jeringa a la aguja, teniendo cuidado de no introducir burbujas.
A continuación, presione lentamente el émbolo de la jeringa para infundir manualmente hasta 1 veces 10 a la novena hepatocitos a través de la vena porta utilizando un catéter de perfusión para controlar la presión poral durante el trasplante. Cuando todas las células hayan sido entregadas, retire el catéter y monitoree la vena porta para detectar la presencia de eventos trombóticos y el flujo hacia adelante por ultrasonido. En una cohorte representativa de cinco cerdos, que se sometieron a resección hepática, la mayoría tuvo rendimientos superiores a 10 a los novenos hepatocitos con aproximadamente 80% de viabilidad.
Proporcionar un número suficiente de células para cualquier tipo de manipulación deseada, incluida la terapia génica. El cultivo posterior de la porción no trasplantada de estos hepatocitos preparados, demostró una buena viabilidad y adhesión con una morfología típica de hepatocitos 46 horas después de su transducción y chapado inicial. Un injerto inicial variará según el número de células reintroducidas durante el trasplante.
Estas biopsias representativas demuestran una cronología de la expansión celular corregida por genes. Es exclusivo de enfermedades, como la tirosinemia hereditaria tipo 1, que gozan de una presión positiva seleccionada para las células sanas. Esta expansión suele completarse 12 meses después del trasplante.
Una vez que un animal knockout de fumarylacetoacetato de fumarylacetoacetato trasplantado ha logrado alrededor del 20% de la re-población de los hepatocitos corregidos dentro del hígado, los niveles de tirosina se normalizarán en comparación con los animales de tipo salvaje. Mientras que los animales no corregidos presentan una elevación significativa tanto en la fosfatasa alcalina como en la transaminasa de aspartato en comparación con los animales de tipo salvaje, la terapia génica ex vivo devuelve estos niveles de enzimas séricas a la normalidad. Además, la salud metabólica hepática general se interrumpe en los cerdos noutados no tratados, como se indica por las elevaciones en el amoníaco circulante que se corrigen después de volver a poblar con los hepatocitos tratados.
Es importante recordar con el uso de esta técnica para manejar y manipular el tejido con cuidado y lo menos posible. Aumento del manejo o manipulación del tejido, conduce a disminuir la viabilidad de las células y disminuir el rendimiento. Este enfoque también puede ser aplicable a las personas que están interesadas en estudiar la distribución de arcos y graficiencias gráficas en técnicas de etiquetado, utilizando otras técnicas fuera de los protocolos de transducción viral.
No olvide que trabajar con vectores virales puede ser peligroso, por lo que es necesario seguir los procedimientos de biosecuerpo adecuados, así como usar equipos de protección personal cuando se utilizan estas técnicas.
