肝臓における代謝の生まれ変わりエラーの治療のためのEx vivo遺伝子治療および自己細胞移植は、これらの障害に対する治療に代わる重要な代替手段である。そして、これらの疾患を治療するだけでなく、治療結果を達成するために必要なバイオマスを把握することができます。このアプローチはまた、免疫抑制の重大な結果および異なるタイプの治療法による他の結果を回避する。
現在の文脈では、遺伝性チロシン血症タイプ1を治療するためにこのアプローチを使用しています。しかし、これは最小限の変化で多数の異なる肝疾患を治療するためのプラットフォームアプローチになるという考え方です。移植のために実行可能な肝細胞を得るために不可欠な灌流の効率を視覚化することになると、この技術を視覚化できることが重要です。
ロバート・カイザーとジョセフ・リレガードによって行われた外科的処置。ゼジ・デュ、ブルース・アミオットによって行われた細胞分離。UAU細胞の精製および細胞のex生体導入はケイトリン・ヴァンリスによって行った。
動物とOR準備の準備は、カリ・アレンとローリー・ヒリンによって行われました。最初のポートサイトエントリを実行するには、麻酔の臍にオープンハッソンテクニックセファラッドを実行します, 最大 3 ヶ月, 大きな, 白い農場の豚.腹膜が見える腹腔に12ミリメートルのトロカールを導入する。
トロカールが設置されたら、入り口口を通って5ミリメートル30度の範囲を通過し、水銀の15ミリメートルに二酸化炭素で腹部を窒息させます。腹腔鏡カメラで直接可視化下に、肝臓の左側面葉に三角測量を行い、さらに5ミリメートルのポートを2つ配置します。そして、1つの新しいポートに腹腔鏡を置きます。
内側と左横のセグメントを分離する左葉の主要な裂け目の点で肝臓の左横セグメントを識別します。そして、この裂け目に沿って血管構造と肝静脈を確保するために外科用ホッチキスを使用してください。順次焼成と60、45、または30ミリメートルの長い血管負荷を使用して、この裂け目を通してパレンチマをトランセクトします。
切除が完了したら、残った肝臓を評価して十分な止止まりを確認し、内視鏡的な把握器と内視鏡組織検索バッグを使用して肝臓セクションを取り出します。次に、ポートを取り外し、正中筋膜に割り込まれたサイズのゼロ縫合線を使用します。深い真皮層のランニング2-0縫合線。
そして、閉下層に対する4〜0の縫合糸を、3層で12ミリメートルのポート切開を閉じる。次に、2~0縫合を使用して、1つの層の5ミリメートルポートを閉じます。そして、切開部に無菌ドレッシングを置きます。
肝細胞の単離のために、まず、43°Cの水浴中に維持された分散液を送達するために設定された蠕動ポンプを、肝臓セクションの大きな露出した血管に置くカテーテルに接続する。ポンプとチューブを2つの溶液を灌流して、組織への灌流1と灌流2溶液の間で切り替える停止コック位置までをプライムする。そして、停止コックを灌流1位に切り替えます。
その後、チューブセットの残りの部分をプライムします。組織に気泡を導入するのを防ぐために、インラインバブルトラップを完全に充填します。次に、平素の静脈枝の断面とカテーテル用の肝静脈を明らかにするために、肝循環に垂直なきれいな横切開を行います。
そして、利用可能な、露出した静脈をカテーテル化するためにぴったりしたフィッティングカテーテルを使用してください。カテーテルが設置されたら、分毎に100ミリメートルの流量で1溶液を温かく灌流して、切除された肝臓組織を浸透させる。30~60秒ごとに出口管を静脈から静脈に移動する。
そして、避難管を使用して、組織トレイから余分なバッファを取り除く。15〜20分間、利用可能な静脈のすべてをサイクリングした後、同じ条件下で2つの溶液を灌流に切り替えます。戻りポンプを使用して、2つの溶液をリザーバに戻してリサイクルし、より遅い流量で、組織への再投与を行う。
気泡トラップの表面温度を確認し、肝臓を約5分ごとに確認して、肝細胞が寒くなっていないかどうかを確認します。約30分間の灌流の後に肝臓がブランチしたら、組織を滅菌容器に移し、滅菌ドレープで包み、肝細胞処理中に無菌性を維持するために容器を細胞培養フードに入れる。肝細胞のコラゲナーゼ分離と細胞の解離は、細胞の生存率と伝達頻度を低下させる細胞の束を得ないように完全に行う必要があります。
肝臓を肝細胞洗浄媒体で水没させ、組織の上部にハサミをドラッグして肝臓カプセルを破壊する。無菌手袋を着用し、肝臓を穏やかにマッサージして肝臓細胞を培地に放出する。そして、滅菌ガーゼを介して、200ミリリットル遠心分離機ボトルに組織上清をフィルタリングします。
遠心分離により濾過した肝細胞を収集します。新鮮な肝細胞洗浄媒体の150ミリリットルで細胞を2回の追加洗浄のための単一の200ミリリットルのボトルにプールします。そして、第3遠心分離後の細胞を数える。
次いで、ミリリットル塩水濃度あたり9番目の肝細胞に10倍に細胞を希釈する。孤立した肝細胞の自己移植のために、超音波を介して門脈を識別し、5インチ、18ゲージの針を主な門脈に向けて、分岐に近似するために2-5メガヘルツトランスデューサーを使用する。細胞の総容積に応じて細胞を60ミリリットルのシリンジにロードし、注射器を針に取り付け、泡を導入しないように注意する。
次に、注射器プランジャーをゆっくりと押し込み、移植中に注入カテーテルを使用してポータル静脈を介して9番目の肝細胞まで10倍まで手動で注入し、移植中に口腔圧をモニタリングする。すべての細胞が送達されたら、カテーテルを取り外し、超音波による血栓性イベントおよび前方流れの存在について門脈を監視する。肝切除を受けた5匹の豚の代表的なコホートでは、ほとんどが約80%の生存率を有する9番目の肝細胞に10以上の収率を有していた。
遺伝子治療を含む、任意のタイプの所望の操作に十分な数の細胞を提供する。これらの調製された肝細胞の非移植部分のその後の培養は、その導入および初期めっきの46時間後に典型的な肝細胞形態を有する良好な生存率および接着性を示した。最初の生着は、移植中に再導入された細胞の数によって異なります。
これらの代表的な生検は、遺伝子補正細胞拡張のタイムラインを示す。健康な細胞に対して正の選択された圧力を楽しむ遺伝性チロシン血症1型などの疾患に特有の疾患。この拡張は、通常、移植後12ヶ月で完了する。
移植されたフマリア酢酸ヒドロラーゼノックアウト動物が肝臓内で補正された肝細胞の約20%の再集団を達成すると、チロシンレベルは野生型動物と比較して正常化する。未補正動物は、野生型動物と比較してアルカリホスファターゼおよびアスパラギン酸トランスアミン酵素の両方に有意な上昇を示すが、ex vivo遺伝子療法はこれらの血清酵素レベルを正常に戻す。さらに、一般的な肝臓代謝の健康は、未処理の肝細胞で再集団化した後に修正される循環アンモニアの上昇によって示されるように、未処理のノックアウトブタで破壊される。
この技術を使用して、組織を慎重かつ可能な限り少なく処理し、操作することを覚えておくことが重要です。組織の取り扱いまたは操作の増加は、細胞の生存率を低下させ、収率を低下させる。このアプローチは、ウイルス導入プロトコル以外の他の技術を使用して、ラベル技術における弓分布とグラフの非効率性を研究することに興味がある人にも適用できます。
ウイルスベクターを使用することは危険であり、適切なバイオ安全手順に従うだけでなく、これらの技術を使用する際には個人的な保護具を着用することが必要であることを忘れないでください。
