간에서 신진 대사의 태아 오류의 치료를위한 Ex 생체 유전자 치료 및 자가 세포 이식은 이러한 장애에 대한 치료에 중요한 대안이다. 그리고 우리는 이러한 장애를 치료 할뿐만 아니라 치료 결과를 달성하는 데 필요한 바이오 매스를 알아낼 수 있습니다. 이 접근은 또한 면역 억제의 중요한 결과 및 치료의 다른 모형을 가진 그밖 결과를 피합니다.
현재 문맥에서, 우리는 유전 티로시혈증 타입 1을 취급하기 위하여 이 접근법을 사용하고 있습니다. 그러나, 아이디어는이 최소한의 변경으로 다른 간 질환의 무리를 치료하는 플랫폼 접근 방식이 될 것입니다. 이식을 위해 실행 가능한 간세포를 얻는 데 필수적인 관류의 효율성을 시각화할 때 약간의 가변성이 있기 때문에 이 기술을 시각화할 수 있어야 합니다.
로버트 카이저와 조셉 릴레가드에 의해 수행 수술. 세포 격리는 지지 두, 브루스 아미오트에 의해 수행. UAU 세포 정화 및 세포의 전 생체 변환은 케이틀린 반리스에 의해 수행되었다.
동물과 OR 준비의 준비는 카리 앨런과 로리 힐린에 의해 수행되었다. 초기 포트 사이트 항목을 수행하려면 최대 3 개월 된 대형 흰색 농장 돼지의 마취에 열려있는 Hasson 기술을 수행하십시오. 복강이 보이는 복강에 12mm 트로카를 도입합니다.
트로카가 제자리에 있을 때, 진입 항을 통해 5밀리미터 30도 범위를 통과하고 이산화탄소로 복부를 15밀리미터의 수은으로 부수시게 합니다. 복강경 카메라로 직접 시각화하는 과정에서 2개의 5mm 포트를 추가로 배치하여 간 왼쪽 측면 엽에 삼각측량합니다. 그리고 하나의 새로운 포트에 복강경을 배치합니다.
내측 및 왼쪽 측면 세그먼트를 분리하는 왼쪽 엽의 주요 균열 지점에서 간 왼쪽 측면 세그먼트를 식별합니다. 그리고 외과 스테이플러를 사용하여 혈관 구조와 이 균열을 따라 간 정맥을 확보하십시오. 순차적 발사 및 60, 45 또는 30mm 길이의 혈관 하중을 사용하여이 균열을 통해 parenchyma를 경유하십시오.
절제술이 완료되면, 적절한 hemostasis를 보장하고 내시경 손아그및 내시경 조직 검색 가방을 사용하여 간 섹션을 검색하기 위해 남은 간을 평가합니다. 이제 포트를 제거하고 중간 선 근막에 대해 중단된 크기 0 봉합사를 사용합니다. 깊은 진피 층을 위한 2-0 봉합사.
그리고 피하 층을 위한 4-0 봉합사를 실행하여, 3층에서 12밀리미터 포트 절개를 닫는다. 그런 다음 2-0 봉합사로 한 층에서 5mm 포트를 닫습니다. 그리고 절개에 멸균 드레싱을 놓습니다.
간세포 절연을 위해 먼저 43도섭씨급수조로 유지된 분산 용액을 전달하는 연동 펌프세트를 간 단면의 크고 노출된 용기에 배치할 카테터에 연결한다. 관류 2개의 용액으로 펌프와 튜브를 프라임, 관류 하나 및 관류 두 용액 전달 사이를 전환하는 스톱 콕 위치까지. 그리고 스톱 콕을 관류 1 위치로 전환합니다.
그런 다음 튜빙 세트의 나머지 부분을 프라임합니다. 조직에 기포를 도입하는 것을 방지하기 위해 인라인 버블 트랩을 완전히 채웁니다. 다음으로, 깨끗한 횡방향 절개를 하고, 간 순환에 수직으로 하여, 카테터화를 위한 포탈 정맥 가지의 단면을 드러내는다.
그리고 사용 가능한, 노출 된 정맥을 카테터화하는 아늑한 피팅 카테터를 사용합니다. 카테터가 제자리에 있을 때, 분당 100밀리미터의 용액으로 절제된 간 조직을 따뜻한 관류 1개의 용액으로 퍼펫합니다. 콘센트 튜브를 정맥에서 정맥으로 30초에서 60초마다 이동합니다.
그리고 피난 튜브를 사용하여 티슈 트레이에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 15~20분 동안 사용 가능한 모든 정맥을 순환한 후 동일한 조건에서 두 가지 용액으로 전환하십시오. 리턴 펌프를 사용하여 관류 2개의 용액을 저수지로 다시 재활용하여 느린 유량으로 조직내재투여한다.
거품 트랩의 표면 온도 및 간을 약 5분마다 확인하여 간세포가 차가워지지 않는지 확인합니다. 간관은 약 30분간 의 관류 후, 멸균 드랩으로 감싼 멸균 용기에 조직을 옮기고, 간세포 처리 중 멸균을 유지하기 위해 용기를 세포 배양 후드에 넣습니다. 간세포와 세포 분리의 콜라겐아제 분리는 완전히 수행되어야하므로 세포와 트랜스 듀피의 생존가능성을 감소시키는 세포의 응집력을 얻지 못합니다.
간 세포 세척 매체와 간 을 침수 하 고 간 캡슐을 방해 하는 조직의 상단에 걸쳐 가위를 드래그. 멸균 장갑을 착용하고 간을 부드럽게 마사지하여 간장을 중간 크기로 방출합니다. 그리고 멸균 거즈를 통해 200 밀리리터 원심분리기 병으로 조직 상류체를 필터링합니다.
원심분리에 의해 여과된 간구를 수집합니다. 신선한 간세포 세척 매체의 150 밀리리터에 세포를 풀링하여 2개의 추가 세척을 위해 2개의 추가 세척을 위한 단일 200 밀리리터 병으로 합니다. 그리고 세 번째 원심 분리 후 세포를 계산.
그런 다음, 밀리리터 식염수 농도당 9번째 간세포로 세포를 1회 10배까지 희석시한다. 격리된 간세포의 자동 이식을 위해 2-5메가헤르츠 트랜스듀서를 사용하여 초음파를 통해 포문 정맥을 식별하고 5인치, 18게이지 바늘을 주 포털 정맥쪽으로 지시합니다. 총 세포 부피에 따라 60 밀리리터 주사기에 세포를 로드하고 주사기를 바늘에 부착하여 거품을 유발하지 않도록 주의하십시오.
다음으로, 주사기 플런저를 천천히 우울하여 이식 중에 포알 압력을 모니터링하기 위해 주입 카테터를 사용하여 포털 정맥을 통해 1배에서 9번째 간세포까지 수동으로 주입한다. 모든 세포가 전달되면 카테터를 제거하고 혈전 증시의 존재와 초음파에 의한 전진 흐름을 위해 포털 정맥을 모니터링하십시오. 간 절제술을 받은 돼지 5마리의 대표적인 코호트에서는 대부분 10대에서 9번째 간세포까지 약 80%의 생존율을 보였습니다.
유전자 치료를 포함하여 원하는 조작의 모든 모형을 위한 세포의 충분한 수를 제공합니다. 이들 준비된 간세포의 비이식 부분의 후속 배양은, 그들의 트랜스듀션 및 초기 도금 후에 전형적인 간구 체형 모폴로지 46시간 후에 좋은 생존력 과 접착을 보여주었습니다. 초기 이식은 이식 중에 재도입된 세포의 수에 따라 달라집니다.
이 대표적인 생검은 유전자 보정된 세포 확장의 타임라인을 보여줍니다. 건강한 세포에 대한 양수 선택 압력을 즐기는 유전 티로시혈증 제 1형과 같은 질병에 국한되어 있습니다. 이 확장은 일반적으로 이식 후에 12 달 완료됩니다.
이식된 fumarylacetoacetate 하이드로라세테이트 수압 녹아웃 동물이 간 내의 교정 된 간세포의 약 20 %의 재인구를 달성하면 티로신 수준은 야생 형 동물에 비해 정상화됩니다. 교정되지 않은 동물은 야생 형 동물에 비해 알칼리성 인산염과 아스파트 아파르타트 트랜스 아미나아제 모두에서 상당한 고도를 나타내지만, 전 생체 유전자 치료는 이러한 혈청 효소 수준을 정상으로 반환합니다. 또한, 일반적인 간 대사 건강은 치료된 간세포로 재인구 후 교정되는 순환 암모니아의 고도에 의해 표시된 바와 같이 치료되지 않은 녹아웃 돼지에서 중단된다.
이 기술을 사용하여 조직을 가능한 한 적게 처리하고 조작하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 조직의 처리 또는 조작이 증가하면 세포의 생존가능성을 감소시키고 수율을 감소시깁니다. 이 접근 방식은 바이러스 성 트랜스듀션 프로토콜 이외의 다른 기술을 사용하여 라벨링 기술의 활 분포 및 그래프 비효율성을 연구하는 데 관심이 있는 사람들에게도 적용될 수 있습니다.
바이러스 벡터로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 적절한 생체 안전 절차를 따르고 이러한 기술을 사용할 때 개인 보호 장비를 착용하는 것이 필요합니다.
