Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones proteicas al permitir la detección de nuevos socios de unión para proteínas extracelulares, tanto en alto rendimiento como con alta sensibilidad. La principal ventaja de este método es que, con sólo unos pocos microgramos de proteína, puede generar cientos de diapositivas utilizando la impresora de micro array. Utilice un micro arrayer estándar para la impresión de diapositivas.
Este instrumento tiene una capacidad de 57 diapositivas por carrera, utiliza un cabezal de impresión que contiene 48 pasadores de detección y puede acomodar hasta 8.000 puntos por diapositiva. Genere placas de trabajo utilizando 384 placas de pozo a 10 microlitros de muestra por pozo de las placas de stock. Realice este paso manualmente, antes de la impresión de diapositivas con el micro arrayer.
A continuación, detecte proteínas con pasadores de manchas de tipo pluma en los portaboganos de silano epoxi a 60% de humedad para evitar la deshidratación de las manchas proteicas. La albúmina sérica bovina con etiqueta Cy3 se puede detectar por duplicado entre cada muestra de proteína para visualizar la matriz para el ajuste de la máscara. Después de la impresión, retire los portaobjetos de micro matriz de proteínas del entorno humidificado.
A continuación, utilice un fogger ultrasónico para generar una fina niebla de solución de bloqueo que se asienta sobre la superficie de la diapositiva. Luego, bloquee las diapositivas durante la noche con 5% de leche en PBST para desactivar la superficie. Almacene los portaobjetos a menos 20 grados centígrados en 50% de glicerol para evitar la congelación.
Las interacciones entre las proteínas extracelulares a menudo se caracterizan por sus bajas afinidades. Para permitir la detección de estas interacciones, aumentando la avidez de unión, desarrollamos un enfoque multivalente basado en la captura de la proteína consultada expresada como dominios extracelulares etiquetados por FC en microcas recubiertas de proteína A. Gire el portador IgG, que ha sido etiquetado con el tinte reactivo mono Cy5 como se describe en el protocolo de texto.
Para calcular la relación molar de la proteína de consulta y Cy5 IgG, divida el peso molecular de la proteína de consulta por el peso molecular del IgG y multiplique por 40 microgramos por mililitro para determinar la concentración de Cy5 IgG necesaria. Una vez que todas las proporciones se han determinado formando el complejo de proteína micro cordón mediante la combinación de la consulta etiquetada FC y el Cy5 IgG con la proteína A micro perlas. Mezclar la suspensión en PBS en un rotador de tubo durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz.
Para comenzar el cribado, caliente los portaobjetos preparados a temperatura ambiente antes de cargarlos en la estación de hibridación. Para realizar el cribado, primero lave la micro matriz con PBST durante un minuto para eliminar el glicerol residual. Cargue 200 microlitros de un miligramo por mililitro de proteína A en PBS 5% leche e incubar durante 30 minutos para evitar que las micropartitas de proteína A sin complejos se unan a proteínas etiquetadas por FC que pueden estar presentes en la micro matriz.
Después de que la estación de hibridación lave los portaobjetos con PBST, cargue 200 microlitros del complejo de micro cordón de consulta, en presencia de un miligramo por mililitro de proteína A e incubar durante 30 minutos. Después de la hibridación y lavado de los portaobjetos por la estación de hibridación, enjuague los toboganes con agua y colóquelos en tubos cónicos individuales de 50 mililitros. Seque los tubos girando a 900 veces G durante cinco minutos.
Por último, escanee las diapositivas con un escáner de micro array adecuado para detectar la fluorescencia Cy3 y Cy5 a través de emocionantes a 532 y 635 nanómetros, respectivamente. Aquí se muestra una imagen representativa de una diapositiva impresa. Las manchas de albúmina sérica bovina con la etiqueta Cy3 están en verde.
Las manchas se imprimieron por duplicado como un control de calidad del proceso de impresión. Aquí se muestran los resultados representativos de una proteína huérfana, examinada para la identificación de socios de unión utilizando la tecnología de micro array de proteína extracelular. Las manchas rojas duplicadas se identifican como un éxito para la proteína de consulta filtrada.
Este método que se describe es altamente versátil y se puede utilizar para la impresión de una gama de bibliotecas de proteínas, ya sean familias de proteínas específicas o grandes compilaciones de proteínas como la nuestra. Se puede evaluar cualquier proteína de interés. Al intentar este procedimiento es importante manejar los portaobjetos con cuidado y asegurarse de que no se sequen para evitar la pérdida de actividad de las proteínas impresas.
Siguiendo la pantalla de una proteína de interés, se recomienda validar aún más los impactos observados mediante el uso de tecnologías ortogonales, como la resonancia de plasmón superficial. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores estudien las interacciones de proteínas extracelulares en humanos.
