Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия белкового белка, позволяя обнаруживать новых связывающих партнеров для внеклеточных белков, как при высокой пропускной способности, так и с высокой чувствительностью. Основным преимуществом этого метода является то, что, с помощью всего лишь нескольких микрограммов белка, вы можете генерировать сотни слайдов с помощью принтера микро массива. Используйте стандартный микро массивер для слайд-печати.
Этот инструмент имеет емкость 57 слайдов на пробег, использует печатаную головку, держащую 48 пятнистых булавок, и может вместить до 8000 пятен на слайд. Создайте рабочие пластины с использованием 384 пластин на 10 микролитров образца на колодец из фондовых пластин. Выполните этот шаг вручную, перед слайд-печатью с помощью микро массивера.
Затем месте белков с пером типа пятнистость булавки на эпоксидной силан слайды на 60% влажности, чтобы предотвратить обезвоживание белковых пятен. Cy3 помечены бычьей сыворотки альбумин могут быть замечены в дубликате между каждым образцом белка, чтобы визуализировать массив для маски установки. После печати удалите слайды микро массива белка из увлажненной среды.
Далее используйте ультразвуковой противотуманной для создания тонкого тумана блокирующего раствора, который оседает на поверхности слайда. Затем, блокировать слайды на ночь с 5%молока в PBST для enactivate поверхности. Хранить слайды при температуре минус 20 градусов по Цельсию в 50%глицерола, чтобы предотвратить замораживание.
Взаимодействия между внеклеточными белками часто характеризуются их низким сродством. Чтобы обеспечить обнаружение этих взаимодействий, увеличивая связывающую алчность, мы разработали многовалентный подход, основанный на захвате запрошенного белка, выраженного как FC помеченные внеклеточные домены на белке A с покрытием микро шариков. Спин перевозчика IgG, который был помечен с Cy5 моно реактивный краситель, как описано в текстовом протоколе.
Чтобы вычислить молярное соотношение белка запроса и Cy5 IgG, разделите молекулярный вес белка запроса на молекулярный вес IgG и умножьте на 40 микрограмм на миллилитр, чтобы определить концентрацию необходимой Cy5 IgG. После того, как все соотношения были определены форме микро бисер белка комплекса путем объединения FC помечены запрос и Cy5 IgG с белком микро шарики. Смешайте подвеску в PBS на трубчатом ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
Чтобы начать скрининг, разогреть подготовленные горки при комнатной температуре перед погрузкой на станцию гибридизации. Для проведения скрининга сначала смойте микро массив с помощью PBST в течение одной минуты, чтобы удалить остаточный глицерол. Загрузите 200 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр белка А в PBS 5%молока и инкубировать в течение 30 минут, чтобы предотвратить несогласоваемый белок микробусы от связывания с белок с тегами FC, которые могут присутствовать в микро массиве.
После гибридизации станция моет горки с помощью PBST, загружает 200 микролитров микро шарикового комплекса запроса, в присутствии одного миллиграмма на миллилитр белка А и инкубирует в течение 30 минут. После гибридизации и мытья горок на станции гибридизации, промыть горки водой и поместить их в отдельных 50 миллилитров конических труб. Высушите трубки, вращаясь на 900 раз G в течение пяти минут.
Наконец, сканируйте слайды с помощью микро-сканера массива, подходящего для обнаружения флуоресценции Cy3 и Cy5 с помощью захватывающих на 532 и 635 нанометров, соответственно. Здесь показано репрезентативное изображение печатного слайда. Cy3 помечены бычьей сыворотки альбумин пятна в зеленом цвете.
Пятна были напечатаны дубликатом в качестве контроля качества процесса печати. Здесь показаны репрезентативные результаты осиротевшего белка, скрининг для идентификации связывающих партнеров с использованием технологии внеклеточного белкового микро массива. Двойные красные пятна идентифицируются как хит для экранируемого белка запроса.
Этот метод, который описывается является весьма универсальным и может быть использован для печати гамму белковых библиотек, будь то конкретные семьи белков или большие сборники белков, таких как наша. Любой белок, представляющий интерес, может быть оценен. При попытке этой процедуры важно обращаться с слайдами с осторожностью и убедиться, что они не высыхают, с тем чтобы предотвратить потерю активности напечатанных белков.
После экрана белка, представляющих интерес, настоятельно рекомендуется для дальнейшей проверки любых хитов наблюдается с помощью ортогональных технологий, таких как поверхностный плазмонный резонанс. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей для изучения внеклеточных белков взаимодействий в организме человека.
