この方法は、高スループットと高感度の両方で、細胞外タンパク質の新規結合パートナーの検出を可能にすることで、タンパク質相互作用の分野における主要な質問に答えることができます。この方法の主な利点は、タンパク質の数マイクログラムで、マイクロアレイプリンタを使用して何百ものスライドを生成できることです。スライド印刷には標準のマイクロアレイを使用します。
この器械は1回の実行の57スライドの容量を有し、48スポッティングピンを保持する印刷ヘッドを使用し、スライドごとの8,000までのスポットを収容することができる。ストックプレートから1ウェルあたり10マイクロリットルのサンプルで384ウェルプレートを使用して作業プレートを生成します。マイクロ・アレイを使用してスライド印刷する前に、このステップを手動で実行します。
次に、クイル型スポッティングピンを持つタンパク質を60%の湿度でエポキシシランスライドにスポットし、タンパク質スポットの脱水を防ぎます。Cy3標識されたウシ血清アルブミンは、各タンパク質サンプル間で重複して発見され、マスクフィッティング用アレイを可視化することができる。印刷後、加湿環境からタンパク質マイクロアレイスライドを取り除きます。
次に、超音波フォグゲージャーを使用して、スライド表面に落ち着くブロッキング溶液の微細な霧を生成します。その後、PBSTで5%ミルクでスライドを一晩ブロックし、表面を活性化させます。凍結を防ぐために50%グリセロールでマイナス20°Cでスライドを保存します。
細胞外タンパク質間の相互作用は、しばしばその低い親和性によって特徴付けられる。これらの相互作用の検出を可能にするために、結合アビディティを増加させることにより、FCタグ付き細胞外ドメインとして発現した問い合わせタンパク質の捕捉に基づく多価のアプローチを開発した。キャリアIgGをスピンし、テキストプロトコルに記載されているようにCy5モノ反応色素で標識されている。
クエリタンパク質とCy5 IgGのモル比を計算するには、クエリタンパク質の分子量をIgGの分子量で割り、1ミリリットル当たり40マイクログラムを掛けて必要なCy5 IgGの濃度を決定します。すべての比率が決定されると、FCタグ付きクエリとCy5 IgGをタンパク質Aマイクロビーズと組み合わせることで、マイクロビーズタンパク質複合体を形成します。PBSの懸濁液をチューブ回転器で、光から保護された室温で30分間混ぜます。
スクリーニングを開始するには、ハイブリダイゼーションステーションにロードする前に、室温で準備したスライドを温めます。スクリーニングを行うために、まずPBSTでマイクロアレイを1分間洗浄し、残留グリセロールを除去する。PBS 5%milkに1ミリグラムの1ミリグラムの200マイクロリットルをロードし、30分間インキュベートして、未複合タンパク質Aマイクロビーズがマイクロアレイに存在する可能性のあるFCタグ付きタンパク質に結合するのを防ぎます。
ハイブリダイゼーションステーションがPBSTでスライドを打ち上げ、クエリマイクロビーズ複合体の200マイクロリットルを、1ミリグラムのタンパク質A当たり1ミリグラムの存在下で、30分間インキュベートする。ハイブリダイゼーションステーションによるスライドのハイブリダイゼーションと洗浄に続いて、スライドを水で洗い流し、それらを個々の50ミリリットル円錐形チューブに入れます。Gの900倍で5分間回転させてチューブを乾燥させます。
最後に、532ナノメートルと635ナノメートルでエキサイティングにCy3とCy5蛍光を検出するのに適したマイクロアレイスキャナでスライドをスキャンします。ここに示されているのは、印刷されたスライドの代表的な画像です。Cy3ラベル付きウシ血清アルブミンスポットは緑色です。
印刷工程の品質管理として、スポットを複製印刷しました。細胞外タンパク質マイクロアレイ技術を用いて結合パートナーの同定をスクリーニングした孤立タンパク質の代表的な結果を、ここに示す。重複する赤い斑点は、スクリーニングされたクエリタンパク質のヒットとして識別されます。
記載されているこの方法は非常に汎用性が高く、特定のタンパク質ファミリーまたは当社のようなタンパク質の大規模なコンパイルなど、タンパク質ライブラリの範囲の印刷に使用することができます。関心のある任意のタンパク質を評価することができます。この手順を試みる間は、慎重にスライドを処理し、それらが印刷されたタンパク質の活性の損失を防ぐために乾燥しないようにすることが重要です。
目的のタンパク質の画面に続いて、表面プラズモン共鳴などの直交技術を使用して観察されたヒットをさらに検証することを強くお勧めします。その開発後、この技術は、研究者がヒトの細胞外タンパク質相互作用を研究する道を開きました。
