이 방법은 높은 처리량과 높은 감도 모두 세포 외 단백질에 대한 새로운 결합 파트너의 검출을 가능하게함으로써 단백질 단백질 상호 작용 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 몇 마이크로그램의 단백질만 으로 마이크로 어레이 프린터를 사용하여 수백 개의 슬라이드를 생성할 수 있다는 것입니다. 슬라이드 인쇄에 표준 마이크로 어레이어를 사용합니다.
이 계측기는 런당 57개의 슬라이드를 사용할 수 있으며, 48개의 스포팅 핀을 들고 있는 프린트 헤드를 사용하며 슬라이드당 최대 8, 000개의 스팟을 수용할 수 있습니다. 스톡 플레이트에서 잘 샘플 10 마이크로 리터에서 384 개의 웰 플레이트를 사용하여 작업 플레이트를 생성합니다. 마이크로 어레이를 사용하여 슬라이드 인쇄하기 전에 이 단계를 수동으로 수행합니다.
그런 다음 에폭시 실레인 슬라이드에 퀼 타입 스포팅 핀이 있는 단백질을 60%의 습도로 찾아 단백질 반점의 탈수를 방지합니다. Cy3 표지된 소 혈청 알부민은 마스크 피팅을 위한 어레이를 시각화하기 위해 각 단백질 샘플 사이에 중복된 것으로 발견될 수 있다. 인쇄 후, 가습 된 환경에서 단백질 마이크로 어레이 슬라이드를 제거합니다.
다음으로 초음파 포저를 사용하여 슬라이드 표면에 정착하는 차단 용액의 미세한 안개를 생성합니다. 그런 다음 PBST에서 5 %의 우유로 밤새 슬라이드를 차단하여 표면을 활성화시합니다. 동결을 방지하기 위해 50 % 글리세롤에서 영하 20도에서 슬라이드를 저장합니다.
세포 외 단백질 간의 상호 작용은 종종 낮은 친화력을 특징으로합니다. 이러한 상호작용의 검출을 가능하게 하기 위해, 결합 적 확대를 증가시킴으로써, 우리는 FC태그가 지정된 쿼리된 단백질의 캡처에 기초하여 다원적 접근법을 개발했다 단백질 A 코팅 마이크로 비드에 세포외 도메인을 태그. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Cy5 모노 반응성 염료로 레이블이 지정된 반송파 IgG를 회전합니다.
쿼리 단백질 및 Cy5 IgG의 어금니 비율을 계산하기 위해, 질의 단백질의 분자량을 IgG의 분자량으로 나누고 밀리리터당 40 마이크로그램을 곱하여 Cy5 IgG의 농도를 결정한다. 일단 모든 비율이 결정되면 FC 태그 쿼리및 Cy5 IgG를 단백질 A 마이크로 비드와 결합하여 마이크로 비드 단백질 복합체를 형성하였다. 실내 온도에서 30분 동안 튜브 회전기에서 PBS의 서스펜션을 혼합하여 빛으로부터 보호합니다.
스크리닝을 시작하려면, 하이브리드화 스테이션에 로드하기 전에 실온에서 준비된 슬라이드를 따뜻하게 한다. 스크리닝을 수행하려면 먼저 PBST로 마이크로 어레이를 1분 동안 세척하여 잔류 글리세롤을 제거합니다. PBS 5%우유에 밀리리터 단백질 A당 1밀리그램의 200 마이크로리터를 적재하고 30분 동안 배양하여 복잡하지 않은 단백질 A 마이크로 비즈가 마이크로 어레이에 존재할 수 있는 FC 태그 단백질에 결합하지 못하도록 합니다.
혼성화 스테이션이 PBST로 슬라이드를 감산한 후, 밀리리터 단백질 A당 1밀리그램이 존재하여 쿼리 마이크로 비드 복합체200 마이크로리터를 적재하고 30분 동안 배양한다. 혼성화 스테이션에 의해 슬라이드의 혼성화 및 세척에 따라, 물로 슬라이드를 헹구고 개별 50 밀리리터 원모형 튜브에 배치합니다. 5 분 동안 900 배 G에서 회전하여 튜브를 건조.
마지막으로, 각각 532 및 635 나노미터에서 흥미 진진한 으로 Cy3 및 Cy5 형광을 검출하는 데 적합한 마이크로 어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하십시오. 여기에 인쇄된 슬라이드의 대표적인 이미지가 표시됩니다. Cy3 라벨소 소 세럼 알부민 스팟은 녹색입니다.
반점은 인쇄 공정의 품질 관리로 복제하여 인쇄되었습니다. 세포외 단백질 마이크로 어레이 기술을 사용하여 결합 파트너의 식별을 위해 선별된 고아 단백질의 대표적인 결과는 여기에 나와 있다. 중복 된 적색 반점은 선별 된 쿼리 단백질에 대한 히트로 식별됩니다.
설명되는 이 방법은 매우 다재다능하며 단백질 라이브러리의 영역 인쇄에 사용될 수 있으며, 특정 단백질 패밀리 또는 우리와 같은 단백질의 큰 편집이 될 수 있습니다. 관심있는 단백질은 평가 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 주의슬라이드를 처리하고 인쇄된 단백질의 활동 손실을 방지하기 위해 건조하지 않도록 하는 것이 중요합니다.
관심 있는 단백질의 스크린에 이어, 표면 플라스몬 공명과 같은 직교 기술을 사용하여 관찰된 모든 안타를 더 검증하는 것이 좋습니다. 개발 후, 이 기술은 연구원이 인간에 있는 세포외 단백질 상호 작용을 공부하는 쪽을 포장했습니다.
