Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la latencia en la planta leñosa, como por qué los cogollos de flores necesitan acumularse fríos durante el invierno para florecer correctamente. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación del almidón en muestras muy pequeñas de primordium floral. Este enfoque es muy útil para detectar la actividad fisiológica del primordium de la flor durante la latencia y también se puede aplicar a otras especies de árboles como el albaricoque o la ciruela.
Aunque este método puede proporcionar una visión del brote de flores latente, también se puede aplicar a otros procesos como la fase reproductiva desde la polinización hasta el inicio de la fructificación. Para empezar, recoge cinco disparos desde el campo. A continuación, pesar y fijar 10 cogollos de flores en un tubo de vidrio de 10 mililitros con solución fijadora durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados.
Después de esto, deseche el fijador y agregue suficiente 75%etanol para cubrir las muestras. Obtén tres brotes de 15 a 30 centímetros de longitud y cinco milímetros de diámetro con 10 cogollos de flores cada uno. A continuación, coloque los brotes en la espuma de la floristería empapada en agua en una cámara de crecimiento.
Después de 10 días en la cámara de crecimiento, retire los brotes de flores de los brotes y pesarlos. Cada semana desde el comienzo del otoño hasta el bullo en primavera, evaluar el crecimiento de los brotes de flores. Retire las escamas externas de cada muestra y, a continuación, coloque cada brote en el cristal de un relojero que contenga un 75% de etanol.
Usa fórceps de precisión y un bisturí oftalmológico para diseccionar los cogollos y obtener al menos un primordium floral de cada brote. Incrustar las muestras individualmente en cera de parafina para formar un bloque y secciones en un microtomo rotativo. Después de secciones las muestras, aplique una gota de yodo fresco de Lugol sobre una sección.
Después de cinco minutos, retire el exceso de manchas con papel hinchado. A continuación, aplique una pequeña gota de medios de montaje sintéticos, coloque un pequeño vidrio de cubierta sobre la muestra y presione con fuerza. Una vez que el medio de montaje esté seco, observe la sección manchada bajo un microscopio de campo brillante.
En primer lugar, ajuste el diafragma de apertura y el control de brillo de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, asegúrese de que no haya filtros en el soporte del filtro y seleccione una condición de campo brillante en el microscopio. Después de esto, ajuste la configuración de la cámara para la preparación manchada sin tejido.
Fijar el brillo al 50%Siguiente activar la función de sobreexposición/subexposición y ajustar el tiempo de exposición en el límite de sobreexposición. Aplique la función de balance de blancos y la corrección de sombreado. Mida el nivel de gris de la imagen resultante en blanco y negro de la preparación manchada sin tejido.
A continuación, aplique un filtro 4N, adquiera otra imagen en blanco y negro de la preparación y mida el nivel de gris. A continuación, adquiera una imagen de la misma preparación sin luz y mida el nivel de gris de la imagen resultante y calibrar. Después de esto, adquiera una imagen en color de una sección de muestra en formato TIFF con una resolución de al menos 300 ppp.
Cree una imagen binaria correspondiente al área manchada y, a continuación, establezca los tres umbrales de color hasta que la imagen binaria refleje exactamente los gránulos de almidón teñido. Repita este proceso con otras preparaciones y tejidos para ajustar los niveles de detección finales. Usando el sistema de análisis de imágenes, mida la suma de la densidad óptica de cada píxel debajo de la máscara para cuantificar el contenido del almidón en el campo.
En este protocolo, el crecimiento de los brotes florales y el estado de latencia se evaluaron midiendo el aumento del peso de los cogollos después de 10 días en condiciones adecuadas. Durante la latencia, no se observaron cambios después de 10 días en condiciones adecuadas. Una vez que la latencia fue superada, los cogollos se hincharon y estallaron en la cámara de crecimiento.
El contenido de almidón en el primordium de ovario se cuantificó mediante el análisis de imágenes en cada sección microtomada. Consistentemente, la cantidad de almidón a principios del invierno presentó un valor de densidad óptica inferior a 40.000 y la cantidad máxima alcanzó un valor entre 120.000 y 140.000 durante ambos años del estudio. Teniendo en cuenta la latencia, la cantidad máxima de almidón se produjo de forma concomitante con el enfriamiento durante ambos años.
Es importante recordar que los niveles de detección utilizados por el analizador de imágenes dependen directamente de la calibración del sistema. Esto incluye la condición de la luz, la intensidad de la mancha y la ampliación del microscopio. Esta condición debe ser fijada para todos los preparativos.
La combinación de técnicas histoquímicas con el análisis de imágenes ha resultado muy útil para examinar la reserva de carbohidratos del primordium floral durante las diferentes fases de la latencia. También se puede aplicar a otras especies y tejidos. La relación entre la liberación de latencia y la acumulación de almidón en el ovario primordia desvelada por el uso de este método proporcionan una base sólida para entender la base biológica de los requisitos de latencia y escalofriante.
Los esfuerzos futuros deben centrarse en el estudio de indicadores biológicos fiables que puedan indicar fácilmente el estado de inactividad del árbol. Mientras tanto, el patrón de variaciones de almidón a lo largo de la latencia se puede utilizar para enmarcar más estudios fisiológicos y genéticos.
