يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول السكون في النباتات الخشبية ، مثل لماذا تحتاج براعم الزهور إلى تتراكم البرد خلال فصل الشتاء لزهرة بشكل صحيح. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لك بالكمية من النشا في عينات صغيرة جدا من بريموريدميوم زهرة. هذا النهج مفيد جدا للكشف عن النشاط الفسيولوجي للزهرة primordium أثناء النوم ويمكن أيضا أن تطبق على أنواع الأشجار الأخرى مثل المشمش أو البرقوق.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة برعم زهرة نائمة، ويمكن أيضا أن تطبق على عمليات أخرى مثل مرحلة الإنجاب من التلقيح إلى بداية الإثمار. للبدء، وجمع خمس براعم من الميدان. ثم وزن وإصلاح براعم الزهور 10 في أنبوب زجاجي 10 ملليلتر مع حل المثبت لمدة 24 ساعة على الأقل في أربع درجات مئوية.
بعد ذلك، تجاهل المثبت وإضافة ما يكفي من الإيثانول 75٪ لتغطية العينات. الحصول على ثلاثة براعم التي هي 15 إلى 30 سم في الطول وخمسة ملليمترات في القطر مع 10 براعم الزهور لكل من. ثم ضع البراعم على رغوة بائع الزهور الغارقة في الماء في غرفة النمو.
بعد 10 أيام في غرفة النمو، وإزالة براعم زهرة من يطلق النار ووزنها. كل أسبوع من بداية الخريف حتى بربورست في الربيع، وتقييم نمو براعم الزهور. إزالة المقاييس برعم الخارجية من كل عينة، ثم وضع كل برعم في الزجاج صانع الساعات التي تحتوي على 75٪ الإيثانول.
استخدام ملقط الدقة ومشرط العيون لتشريح البراعم والحصول على ما لا يقل عن زهرة primordium واحد من كل برعم. تضمين العينات بشكل فردي في شمع البارافين لتشكيل كتلة وقسمها على microtome دوارة. بعد قسم العينات، وتطبيق قطرة من اليود لوغول الطازجة على قسم.
بعد خمس دقائق، إزالة وصمة عار الزائدة مع ورقة النشاف. تطبيق المقبل قطرة صغيرة من تركيب الوسائط الاصطناعية، ووضع غطاء زجاجي صغير على العينة، واضغط الثابت. مرة واحدة في تصاعد وسائل الإعلام الجافة، ومراقبة القسم الملون تحت المجهر brightfield.
أولاً ضبط الحجاب الحاجز الفتحة وتحكم السطوع وفقا لبروتوكول النص. ثم تأكد من عدم وجود مرشحات في حامل المرشح وحدد حالة brightfield في المجهر. بعد ذلك، ضبط إعدادات الكاميرا لإعداد الملون دون الأنسجة.
قم بإصلاح السطوع بنسبة 50٪ قم بتنشيط وظيفة التعرض المفرط/التعرض الناقص وضبط وقت التعرض عند الحد الأقصى من التعرض. تطبيق الدالة توازن اللون الأبيض وتصحيح التظليل. قياس مستوى الرمادي للصورة الناتجة بالأبيض والأسود من إعداد الملون دون الأنسجة.
ثم تطبيق مرشح 4N ، والحصول على صورة أخرى بالأبيض والأسود لإعداد وقياس مستوى الرمادي. المقبل الحصول على صورة من إعداد نفسه دون ضوء وقياس المستوى الرمادي للصورة الناتجة ومعايرة. بعد ذلك، الحصول على صورة ملونة من مقطع عينة بتنسيق TIFF مع دقة 300 نقطة في البوصة على الأقل.
إنشاء صورة ثنائية المقابلة للمنطقة الملطخة، ثم تعيين عتبات اللون الثلاثة حتى تعكس الصورة الثنائية بالضبط حبيبات النشا الملون. كرر هذه العملية مع الاستعدادات والأنسجة الأخرى لضبط مستويات الكشف النهائية. باستخدام نظام تحليل الصور، قم بقياس مجموع الكثافة البصرية لكل بكسل تحت القناع لتحديد محتوى النشا في الحقل.
في هذا البروتوكول، تم تقييم نمو برعم الزهور وحالة السكون من خلال قياس الزيادة في وزن البرعم بعد 10 أيام في ظروف مناسبة. أثناء النوم، لم يلاحظ أي تغييرات بعد 10 أيام في ظروف مناسبة. وبمجرد التغلب على السكون، تضخمت البراعم وانفجرت في غرفة النمو.
تم قياس محتوى النشا في البدائي المبيضي عن طريق تحليل الصور في كل قسم microtomed. بشكل مستمر، كمية النشا في أوائل فصل الشتاء قدمت قيمة كثافة بصرية أقل من 40،000 والحد الأقصى للمبلغ وصلت إلى قيمة بين 120، 000 و 140، 000 خلال كل من سنوات الدراسة. مع الأخذ في الاعتبار النوم ، والحد الأقصى للمبلغ من النشا وقعت بالتزامن مع الوفاء تقشعر لها الأبدان خلال كلا العامين.
من المهم أن نتذكر أن مستويات الكشف المستخدمة من قبل محلل الصور تعتمد بشكل مباشر على معايرة النظام. وهذا يشمل حالة الضوء، وشدة وصمة عار، وتكبير المجهر. يجب أن يكون هذا الشرط ثابتة لجميع الاستعدادات.
وقد أدى الجمع بين التقنيات الهستوكيميائية مع تحليل الصور مفيدة جدا لدراسة احتياطي الكربوهيدرات من بريموريدميوم زهرة خلال مراحل مختلفة من النوم. ويمكن أيضا أن تطبق على الأنواع والأنسجة الأخرى. العلاقة بين الإفراج النوم وتراكم النشا في primordia المبيض كشف عنها باستخدام هذه الطريقة توفر أساسا سليما لفهم الأساس البيولوجي لمتطلبات النوم وتقشعر لها الأبدان.
وينبغي تركيز الجهود في المستقبل على دراسة مؤشرات بيولوجية موثوقة يمكن أن تشير بسهولة إلى حالة السكون في الشجرة. وفي الوقت نفسه، يمكن استخدام نمط الاختلافات النشا على طول النوم لتأطير المزيد من الدراسات الفسيولوجية والوراثية.
