Este método puede facilitar el establecimiento de marcadores biológicos para enfermedades de la piel y también reducir el riesgo para los participantes de la investigación clínica. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere un entrenamiento intensivo y no deja cicatrices. Cinco minutos antes de la microbiopsía, coloque un tubo centrífugo vacío de dos mililitros sobre hielo seco durante cinco minutos.
Usar guantes desechables, rocíe las manos y herramientas con 70%etanol antes de desinfectar el sitio de aplicación sobre el tema con una toallita de alcohol. Retire la micro biopsia del paquete de radiación gamma esterilizado sin tocar el microacido y tire del émbolo hasta que se oiga un clic y el émbolo se bloquee en su lugar. Apunte el dispositivo cargado en un ángulo aproximadamente perpendicular a la piel que se va a muestrear, teniendo cuidado de que el área de muestreo esté en una posición fija y aplique el dispositivo sobre la piel dentro de al menos un kilogramo de fuerza.
A continuación, presione el gatillo y mantenga el dispositivo en su lugar durante al menos diez segundos. Si el dispositivo se libera antes de diez segundos, hay una mayor probabilidad de variación en la absorción de sangre y también el análisis posterior. Cuando la muestra haya sido absorbida, tire suavemente del émbolo y del microneedle absorbente de la caja y utilice fórceps estériles para tirar de los dos orificios del microneedle para retirarlo del émbolo.
Agregue 50 microlitros de tampón de extracción al tubo sobre hielo seco y coloque el microhiseido intacto en el tubo en el lado seco de la aguja de hielo hacia abajo. Tenga cuidado de no dejar que la punta del microneedle toque nada durante el proceso de eliminación. Vórtice el tubo durante tres a cinco segundos para recoger algo de material muestreado de la punta del microneedle e incubar el tubo en un bloque de calor o baño de agua durante 30 minutos a 42 grados centígrados.
Al final de la incubación, utilice fórceps estériles para colocar el extremo posterior del nivel de microneedleta con el borde superior del tubo de microfuge y cierre la tapa del tubo de tal manera que la parte superior del microaedle se mantiene en su lugar entre la tapa y el tubo. Centrifugar el tubo para recoger el material muestreado de la capa absorbente del dispositivo y utilizar los fórceps para quitar cuidadosamente el microneedle sin sumergir la punta de nuevo en la solución tampón. Centrifugar la muestra de nuevo y transferir cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de micro centrífuga.
A continuación, agregue 250 microlitros de tampón de acondicionamiento a una membrana de filtro de columna de purificación para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente y diluya el tampón por centrifugación. Añadir 50 microlitros de 70% de etanol a la muestra de ARN extraída con una mezcla suave y transferir la mezcla a la columna de purificación precondicionada. Centrifugar inmediatamente el tubo dos veces para extraer el flujo a través, seguido de un lavado en cien microlitros de tampón de lavado uno.
Para la digestión del ADN, agregue 40 microlitros de mezcla de incubación de ADN recién preparada directamente sobre la membrana de la columna de purificación para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente seguida de un lavado con 40 microlitros de tampón de lavado uno. Al final de la centrifugación, lave la columna con 100 microlitros de tampón de lavado dos y compruebe la columna de purificación en busca de cualquier tampón de lavado residual. Transfiera la columna de purificación a un tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitros suministrado en el kit de extracción de ARN y coloque la punta de la pipeta directamente en la membrana de la columna de purificación para añadir 11 microlitros de agua PRE de ARN a la columna.
Después de una incubación de dos minutos a temperatura ambiente, centrifuga la columna una vez para distribuir el agua del ARN sPRE por toda la columna, y una vez para eluir el ARN. A continuación, almacene la muestra total de ARN a menos 80 grados centígrados si la síntesis de ADNr no se realiza inmediatamente. El microneedle microbiopso absorbente consta de dos capas de placa de acero con una capa absorbente en el medio para el muestreo simultáneo de la piel y la sangre.
El uso de una microbiopsía absorbente sólo induce eritema menor, que no se nota después de 48 horas. Después de la punción, se capturan algunos trozos diminutos de piel cerca de la punta del microaedle y la sangre se absorbe en el papel del filtro. Cuando el microneedle absorbente se retira inmediatamente después de la punción, el volumen de la muestra y la cantidad subsiguiente de ARNm extraído es significativamente menor que el obtenido después de la retención durante diez segundos después de la punción.
Niveles similares de expresión de marcadores de piel se detectan después del uso de la microbiopsía absorbente y su microbiopsía de la piel predecesora mediante análisis cuantitativos de PCR. Pero se detecta un nivel significativamente más alto de expresión de biomarcadores de glóbulos blancos después del muestreo absorbente de la microbiopsía, lo que sugiere que el microneedle microbiopso absorbente funciona mejor para la recolección de sangre mientras mantiene la misma capacidad para la captura de muestras de piel que con la microbiopsía de la piel. Así que al aplicar la técnica, es crucial recordar que aplicar el dispositivo de acuerdo con lo que sugerimos es esencial para obtener resultados fiables.
Por lo tanto, siguiendo este procedimiento, se pueden seguir otros métodos, como la PCR en tiempo real, para el perfilado de expresiones relativamente génicas. Aunque todavía estamos desarrollando el dispositivo, estamos seguros de que la técnica ha allanado el camino para las investigaciones clínicas para realizar muestreos, para la aplicación cosmética o pediátrica dermatológica porque es tan simple y es mínimamente invasiva.
