CMOD Pack le permite modelar células con muy alta precisión y cultivarlas en 2d o 3d. Esto abre oportunidades para estudiar las interacciones célula-célula y la morfogénesis de los nuevos tejidos del motor. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de adoptar para otros laboratorios, no requiere una sala limpia, equipo especializado o reactivos sintetizados personalizados.
Comience por dejar caer pequeñas gotas de la resistencia positiva de la foto sobre el portaobjetos de aldehído, utilizando una pipeta desechable. Gire la diapositiva a 3000 RPM durante 30 segundos usando el codificador de giro, luego colóquela en una placa caliente de 100 grados Celsius durante 1.5 minutos para cotelar la resistencia a la foto. Retire la diapositiva de la placa caliente y coloque una máscara fotográfica con las características deseadas en la parte superior de la diapositiva, pésquela con un trozo de vidrio y cubra toda la configuración en una caja opaca.
Exponga la configuración con una lámpara UV durante dos minutos, desarrolle la diapositiva sumergiéndola en la solución de desarrollo durante tres a cinco minutos, luego enjuague el exceso de solución de revelador con agua, séquela bajo una corriente de aire o nitrógeno. Observe esta luz bajo un microscopio para confirmar el éxito de la fotolitografía y almacenarla en la oscuridad. Agregue una gota de 20 soluciones de oligos modificados con amina micromolar en cada región fotoestampada de la diapositiva y extienda la gota suavemente por toda la región, usando una punta de pipeta, teniendo cuidado de no rayar la diapositiva, hornee la diapositiva en un horno de 65 grados Celsius hasta que la solución de ADN se haya secado por completo, realice una aminación reductora colocando la diapositiva horneada y un plato de cultivo celular de 15 centímetros en una campana extractora en la parte superior. de una coctelera.
Mezcle suavemente 100 miligramos de hidruro de boro de sodio en 40 mililitros de PBS y agréguelo al plato. Luego encienda la coctelera durante 15 minutos. Después de la reacción, lave esta diapositiva dos veces con dodecil sulfato de sodio al 0,1% para eliminar el ADN no reaccionado.
Luego lave el tobogán tres veces con agua. Conduzca este tobogán bajo la corriente de nitrógeno o aire. Finalmente enjuáguelo con acetona para eliminar la resistencia fotográfica restante.
Prepare una solución de anclaje y adaptador universal de cuatro micromolares como se describe en el manuscrito de texto y prepare una solución de coanclar universal de 20 micromolares en PBS. Prepare la suspensión celular resuspiendo el pellet celular en un mililitro de PBS helado o medio libre de suero y transfiera de una a 3 millones de células a una centrífuga de tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 160 veces G durante cuatro minutos.
Resusped el pellet celular obtenido en 75 microlitros de PBS helado o medios libres de suero y añadir 75 microlitros del preparado para la solución de anclaje y adaptador universal micromolar. Mezcle bien e incube durante cinco minutos en hielo, agregue 15 microlitros de la solución universal de coanclado al tubo y mezcle bien, luego incube la muestra durante cinco minutos en hielo. Para eliminar el exceso de oligos de la suspensión celular, agregue un mililitro de PBS helado o medios libres de suero al tubo y mezcle con una pipeta.
Peletizar las células centrifugando a 160 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados, luego desechar el sobrenadante. Repita este paso dos veces más. Resuspónda las células en pbS de col de hielo o medios libres de suero para crear una solución densa celular de al menos 25 millones de células por mililitro, incline ligeramente el portaobjetos de patrón, luego agregue 25 microlitros de esta suspensión celular a la entrada de cada celda de flujo.
Retire el PBS y la solución 1% BSA de la salida, permitiendo que la suspensión de la celda llene la celda de flujo de PDM. Incubar sobre hielo o a temperatura ambiente durante 30 segundos, aspirar cinco microlitros de la suspensión celular desde la salida del portaobjetos y volver a añadirlo a la entrada. Repita esto 10 veces por celda de flujo.
Pipete suavemente PBS o medios libres de suero en la entrada de cada celda de flujo para lavar el exceso de células y recoger la suspensión celular de la salida. Repita esto de dos a cuatro veces hasta que no queden un exceso de celdas en la diapositiva. Para el cultivo 3D, prepare una solución precursora de hidrogel que contenga 2% de DNA y agregue 50 microlitros a la entrada de cada celda de flujo.
Aspire el exceso de líquido desde la salida, impulsando la solución de hidrogel hacia la celda de flujo. Incubar el portaobjetos a 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos para permitir que los hidrogeles se fijen y escindir la adhesión basada en ADN entre las células y la superficie. Agregue 50 microlitros de precursor de hidrogel a un pozo de un portaobjetos de cámara de dos pozos o una placa de seis pozos.
Pipete 10 microlitros de PBS a cada lado de cada celda de flujo. Distribúyalo a lo largo de toda la longitud de la celda de flujo usando una cuchilla de afeitar o pinzas de punto de encuentro y levante suavemente los lados de las celdas de flujo para que el PBS se precipite debajo del hidrogel. Usando una cuchilla de afeitar, mueva la celda de flujo al borde de la diapositiva invirtiendo la diapositiva y empuje la celda de flujo fuera de la diapositiva para que aterrice sobre la hoja de afeitar.
Recoge la celda de flujo de la cuchilla de afeitar con pórceps curvos. Invierta las células de flujo para que las células estén en la parte inferior y colóquelas sobre la gota de la solución precursora de hidrogel. Incubar durante al menos 30 minutos para que el hidrogel que contiene las células patrón pueda unirse a la capa inferior del hidrogel, lo que resulta en la incrustación completa de las células patrón.
Retire la celda de flujo y sumérjala completamente en el medio. Empuje suavemente la celda de flujo con forrceps curvas hasta que se desprenda y flote en el medio, luego deséchela. La cuantificación de la adhesión puntual del ADN a las células etiquetadas con CMO, que aumenta.
en función de la concentración de CMO se representa como la media y la desviación estándar de tres experimentos. Los patrones de ADN se muestran en magenta y las células adheridas etiquetadas con CMO en cian a diferentes concentraciones de CMO. Aquí se muestra una comparación de huvecs etiquetados por CMO y huvecs etiquetados con LMO adheridos a un patrón de ADN lineal.
El patrón de MDCK único VSC MOD pack, y transferido a maitre gel fueron capaces de proliferar y polarizarse después de cinco días de cultivo. Los agregados multicelulares de múltiples capas se crearon alternando capas de células etiquetadas con CMO complementarios. Múltiples poblaciones celulares únicas se pueden modelar juntos con alta precisión y sin contaminación cruzada.
Al intentar este protocolo, es fundamental tener una suspensión celular densa mientras se agregan las células a la diapositiva para maximizar las oportunidades de que las células se adhieran a los puntos de ADN.
