Este trabajo fue apoyado por Marie Curie internacional reintegración subvención.

1. Fabricación de los dispositivos <ol><li> Comprado DTPA-D SU-8 molde de control y SPR220-7 flujo molde de la fundición de Stanford microfluídica ( <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / grupo / fundición</a> ). </li><li> Exponer los moldes de silicona a clorotrimetilsilano (TMCS) de vapor durante 10 min para promover la liberación de elastómero después de los pasos de cocción 9. </li><li> Preparar una mezcla de elastómero a base de silicona y agente de curado (mezclar bien) en dos proporciones distintas 5:1 y 20:1 para el control y moldes de flujo, respectivamente. Las diferentes relaciones son necesarias para la correcta adherencia de capas múltiples. </li><li> Vierta el PDMS 05:01 en la capa de control (aproximadamente 5 mm de altura). Degas el control de la capa y hornear durante 30 minutos a 80 º C. Capa Spin (Laurell, EE.UU.) la mezcla 20:1 de PDMS en la capa de flujo a 2.600 rpm durante 60 segundos y después se hornea a 80 º C durante 30 min. La velocidad recubridora de rotación está optimizado para el accionamiento de la válvula a una presiónde 15 psi. Más rápidas hilatura resultará en una capa delgada con la presión de activación inferior y viceversa. Los dispositivos que usamos tienen un límite de 25 psi en el control y 10 psi en el flujo, encima de la cual la separación del sustrato puede ocurrir. </li><li> Se separa la capa de control del molde. Hazlo despacio y tenga cuidado de no pelar el patrón SU8. A continuación, corte el dispositivo alrededor de su perímetro y perforaciones para acceder a los canales de control. </li><li> Alinear el flujo y capas de control manualmente en un estereoscopio. Iniciar mediante la alineación de la esquina superior izquierda; la válvula de botón (capa de control) debe estar en el centro de la cámara de reacción (capa de flujo). A continuación, alinee la primera fila y suavemente suelte la fila capa de control por fila. Asegúrese de que todas las válvulas de botón están en el medio de las cámaras de reacción y que las válvulas de entrada de direcciones y cruzar los canales de flujo en la posición correcta. El proceso puede ser repetido hasta que todas las filas localmente están alineados. Al final, liberar cualquier tensión en el b PDMSy levantándola cuidadosamente por los lados y las esquinas. No levante demasiado o desalineación puede ocurrir. </li><li> Hornear durante 2 horas a 80 ° C. </li><li> Cortar alrededor del perímetro del dispositivo y pelar el dispositivo de capa dos (chip) del molde de flujo. Perforar agujeros para acceder a los canales de flujo (Figura 1). </li></ol> 2. ADN Arraying y alineación de dispositivos <ol><li> Producir genes sintéticos por PCR de ensamblaje. Los genes sintéticos se componen de promotor T7, sitio de unión al ribosoma (RBS), ORF con dos etiquetas de epítopo (uno en cada extremo), y terminador T7 4. Los genes pueden variar en longitud desde 100 pb hasta, al menos, 5.000 pb. </li><li> Preparar los genes sintéticos para formar clusters de: preparar una mezcla de etileno glicol de poli (1,25%) y D-trehalosa dihidrato (125 mg / ml) y prescindir de 2 l por reacción en 384 pocillos de la placa. Esta solución reducirá unión irreversible del ADN al vidrio, así como para la visualización durante la alineación 10. </li&gt; <li> Transferir los genes sintéticos a la placa de 384 pocillos. Por lo general, las concentraciones de ADN puede variar de 10 ng / l a 100 ng / l concentración final. Añadir dH 2 O hasta un volumen final de 20 l (depende de microarrayer y tipo pin). </li><li> Detectar una serie de genes sintéticos sobre sustratos de vidrio recubiertos con epoxi utilizando un microarrayer. Usamos MicroGrid 610 (Bio Robotics) con los pernos de silicona SMT-S75 (Síntesis paralela, EE.UU.). Contacto impresión del ADN, con estos pernos específicos, los resultados en los puntos con diámetro de aproximadamente 100 micras sobre la superficie del vidrio. Cada pin de carga es suficiente para aproximadamente 100 plazas. Asegúrese de que los campos de fila y columna se corresponden con el dispositivo específico usado. El dispositivo que utilizamos contiene 16 columnas y 40 filas con una separación de 680 m por 320 m, respectivamente. </li><li> Alinear manualmente el dispositivo de microfluidos para el conjunto de genes en un estereoscopio. La mancha de ADN debería estar en el medio de las cámaras de ADN. Iniciar la alineación mediante la localización de la primera fila de puntos below la primera fila de cámaras de ADN. A continuación, poner en línea el resto de las filas de acabado con ajuste de precisión de todo el dispositivo. Una vez que la matriz está alineado se debe tener cuidado para aliviar cualquier tensión en el PDMS, mediante el levantamiento de forma local. Si hay tensión a la izquierda en el PDMS no pueden unirse así a la micromatriz. </li><li> Por último, el dispositivo de enlace a la placa de vidrio por incubación durante la noche en una placa caliente a 80 ° C. </li></ol> 3. Cebado y activar el dispositivo <ol><li> Las válvulas en la capa de control se accionan desde el ordenador utilizando LabVIEW. La secuencia de comandos LabVIEW controla una serie de válvulas de solenoide micro través de una caja de control electrónico (adquirido de Stanford microfluídica Foundry). El colector de la válvula de solenoide está conectada al aire comprimido, que controlan el flujo de aire y la presión en las válvulas de control del aparato. </li><li> Conectar el dispositivo al colector de válvulas de solenoide mediante un tubo de plástico flexible con un diámetro interno de 0,02 &quot;(Tygon) Y acero inoxidable pin (New England pequeños tubos Corporation). </li><li> Llenar los tubos con DDW y se inserte el pasador en los orificios de acceso de la capa de control. Asegúrese de que cada tubo está conectado a su canal de control correspondiente. </li><li> Ejecutar la aplicación de LabVIEW en el equipo para activar los canales de control. Mediante la activación de la válvula de la secuencia de comandos de LabVIEW, se aplica presión de aire, que a su vez empuja el agua en los canales de control de PDMS. Ajustar la presión de aire a 5 psi. Se recomienda para llenar el &quot;sándwich&quot; y las válvulas de la primera dirección, a fin de identificar las conversaciones cruzadas entre canales de control de dispositivos defectuosos. En el caso de las conversaciones cruzadas, el accionamiento de la línea de control &#39;sandwich&#39; dará lugar a la activación de cualquiera de las líneas del cuello o del botón de control. Esto es similar a un cortocircuito en un circuito eléctrico. Un dispositivo con la diafonía es defectuoso y no se puede utilizar. </li><li> Después de que todos los canales de control y las válvulas están llenos de DDW, las válvulas están preparados y ready para bloquear los canales de flujo por debajo de ellos. Aumentar la presión del aire a 15 psi. Activación de la válvula se controla desde un programa de LabVIEW a través de un conjunto de encendido / apagado interruptores conectados a las válvulas solenoides individuales. Cada interruptor controla una línea de control específico a través de la válvula de solenoide correspondiente. Activando el interruptor de botón (en el guión) se aplique presión de aire en el tubo correspondiente. La presión del aire empujará el DDW en la línea de control y dará lugar a la expansión de las válvulas de microfluidos, bloqueando el canal de debajo. La desactivación de una válvula de control, se liberará la presión del aire y liberar posteriormente el bloqueo del canal de flujo respectivo. </li><li> Para asegurarse de que todas las válvulas están abiertas, conectar un tubo a una de las entradas de flujo y de flujo de aire en el dispositivo en psi 4-5. Esto liberará todas las válvulas pegajosas de la placa de vidrio. </li><li> Finalmente, el dispositivo está preparado y listo. Cierre todas las válvulas de entrada y de &quot;cuello&quot;, para iniciar la química de superficie. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Superficie Química <ol><li> Con el fin de facilitar el auto-ensamblaje de una matriz de proteína de la superficie y evitar la adsorción no específica dentro del dispositivo de microfluidos, la superficie se modifica químicamente: </li><li> Para fluir a través de un componente del dispositivo, conecte un tubo nuevo con la solución requerida para uno de los canales de flujo en el dispositivo. Conectar el lado libre del tubo al colector manual y abrir el flujo de presión de aire (5 psi). </li><li> Cargar 40 l de biotina-BSA (1 mg / l) en un tubo nuevo y el flujo de aproximadamente la mitad de ella durante 20 min a través del dispositivo, la BSA se unen a la superficie de epoxi. </li><li> Use Hepes (50 mM) para el lavado de sustrato sin reaccionar entre cada uno de los pasos de química de superficie diferentes. </li><li> Flujo de 25 l estreptavidina (0,5 mg / l) durante 20 min en la parte superior de la biotinilado-BSA. </li><li> Lavar con Hepes para 5 min. </li><li> Cierre el &quot;botón&quot; de la válvula y fluir el resto de la biotinilado-BSA (de la forma descritacama arriba), pasivación de la superficie que rodea el botón. </li><li> Lavar con Hepes para 5 min. </li><li> Liberar el &quot;botón&quot; de la válvula y el flujo de 30 l de Su penta--biotina (0,16 g / l) durante 20 min. El anticuerpo se unirá a la estreptavidina expuesta; específicamente al área bajo el &quot;botón&quot; crear un anti His-tag de matriz. </li></ol> 5. Expresión de proteínas <ol><li> Expresar las proteínas en el dispositivo mediante la transcripción de reticulocitos de conejo acoplado rápido y reacción de traducción. Expresión de proteínas de los genes sintéticos manchas en el dispositivo crea una matriz de proteínas listos para usar. Por ejemplo, uno de tales usos es para una pantalla de unión a proteínas. </li><li> Abrir las válvulas de &quot;cuello&quot; y conejo flujo de reticulocitos rápida acoplado de transcripción y traducción de reacción a través del dispositivo en la cámara de ADN. A continuación, cerrar las válvulas de &quot;sandwich&quot; y separar cada gen a partir de su entorno. Incubar el dispositivo en una placa caliente durante 2,5 horas a 30 ° C. Expresada proteins se difunden desde la cámara de ADN a la cámara de reacción espontánea (válvula de cuello está abierto) y se unen a su anti-anticuerpo bajo el &quot;botón&quot; válvula de inmovilización de la proteína a través de su C-terminal etiqueta. </li><li> Etiquete las proteínas con C-myc anticuerpos Cy3. El anticuerpo se unirá a su epítopo correspondiente, situada en la proteína N-terminal. </li><li> Determinar los niveles de expresión de proteínas con un scanner de microarrays (LS Reloaded, Tecan) utilizando un láser nm 532 y 575 nm filtro de emisión. </li></ol> 6. Los resultados representativos 1. Fabricación de los dispositivos Un diseño gráfico para el dispositivo fue creado por AutoCAD basado en nuestras necesidades experimentales. El diseño fue impreso en una película de transparencia por un fijador de imágenes de alta resolución. Esta transparencia sirve como una fotomáscara en fotolitografía contacto. Una técnica de micromecanizado de superficie se utilizó para crear plantillas de 3-D en una oblea de silicio determinado por los patrones inscritos en tenmascara utilizado. El dispositivo microfluídico se fabricó sobre molde de silicona colada de elastómero de silicona de polidimetilsiloxano (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, EE.UU.) (Figura 1). Cada dispositivo consta de dos capas alineadas PDMS, el flujo y la capa de control. El molde fue expuesto primero a clorotrimetilsilano (TMCS, Aldrich) de vapor durante 10 min para promover la liberación de elastómero después de los pasos de cocción. Una mezcla de elastómero a base de silicona y agente de curado se preparó en dos diferentes proporciones 5:1 y 20:1 para el control y moldes de flujo, respectivamente. La capa de control se desgasificó y se coció durante 30 min a 80 ° C. La capa de flujo fue inicialmente recubrió por centrifugación (Laurell, EE.UU.) a 2.600 rpm durante 60 segundos y se hornea a 80 º C durante 30 min. La capa de control se separó de su molde y de control de los orificios de acceso de canal perforado se. A continuación, las capas de flujo y de control fueron alineados manualmente en un estereoscopio y se cocieron durante 2 horas a 80 ° C. El dispositivo de dos capas se peló fesde el molde de flujo y canales de flujo orificios de acceso fueron perforados. 2. Descripción del dispositivo La capacidad del dispositivo puede variar desde 500 hasta 10.000 células unitarias (Figura 2). El dispositivo consta de dos capas; capa de flujo (gris) y la capa de control (color). La capa de control contienen una variedad de válvulas con una función diferente. Cada celda unidad, en la capa de flujo, se compone de un ADN y una cámara de reacción y es controlado por tres tipos de válvulas micromecánicas; &quot;cuello&quot;, &quot;botón&quot;, y &quot;sándwich&quot; (Figura 2A). &quot;Gen sintético &#39;A manchado depositado dentro de la cámara de ADN es bloqueado de la cámara de reacción por el&quot; cuello &quot;de la válvula (verde). Lavado atrapamiento mecánico y de proteínas de la superficie consolidados en la cámara de reacción se lleva a cabo por el &quot;botón&quot; de la válvula (azul). El &quot;emparedado&quot; válvula permite que cada reacción que se produzca en su propia celda unidad (rojo). Las válvulas de direcciones puede dividir el dispositivo hasta 8 secciones independientes, para diferent ensayo condición. Además, la capa de control contiene válvulas de entrada que permiten el flujo de fluido seleccionado en la capa de flujo. Los canales de control PDMS están llenos con DDW. Cuando una válvula se acciona el aumento de la presión (15 psi) resulta en la expansión de la PDMS. En los lugares donde la membrana es lo suficientemente delgada (es decir, el cruce de control y líneas de flujo), esto es suficiente para bloquear completamente la línea de flujo. La altura media celda unitaria es 10 m, y el volumen promedio de celda unidad es menos de 1 nl. 3. Proteínas de expresión y detección Las proteínas se expresaron en el dispositivo mediante transcripción rápida de reticulocitos de conejo acoplado y reacción de traducción (Promega). La expresión de las proteínas creado una matriz de proteínas listas para su uso en una pantalla de unión (Figura 3). Una mezcla expresión (12,5 l) se cargó en el dispositivo y, a continuación inundado en las cámaras de ADN mediante la apertura de las válvulas de &quot;cuello&quot;. A continuación, los &#39;sandwich&#39; válvulas erancerró dejando cada celda unidad separada de sus células vecinas y el dispositivo se incubó en una placa caliente durante 2,5 horas a 30 ° C. Las proteínas expresadas difunde a través de la cámara de gen en la cámara de reacción, donde su C-terminal Su etiqueta podría enlazar el anticuerpo anti-His (Qiagen), situados bajo el &quot;botón&quot; válvula de inmovilización de la proteína a la superficie. Las proteínas fueron marcadas con Cy3 un C-myc (Sigma), lo que unido a su epítopo correspondiente situado en la proteína N-terminal y la etiqueta él. Los niveles de expresión de proteínas se determinaron con un escáner de microarrays (LS Reloaded, Tecan) utilizando un láser de 532 nm y 575 nm filtro. La matriz de proteína resultante se compone de diferentes niveles de expresión de la proteína. Por lo general, alrededor de 20% de una biblioteca de genes no expresan a niveles detectables. No hay correlación con el tamaño de la proteína se observó 3. Los niveles de fondo se determinaron utilizando cámaras que no estaban manchados con el ADN. Por lo tanto, las señales de las cámaras de proteína correspondiente se deben a una noise o adsorción no específica de los anticuerpos de etiquetado. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fabricación de chips. (A) Los moldes fueron tratados con vapores TMCS de 10 min. (B) PDMS es fundido en moldes de flujo de control y de silicio. (C) Los dos moldes de control de flujo y se cuecen al horno en 80 ° C durante 30 min. (D) La capa de control de pelado del molde, cortado a la medida y las entradas de control están perforadas. (E) La capa de control se alinea con la capa de flujo en un estereoscopio y luego al horno en 80 ° C durante 2 horas. En paralelo a la fabricación de dispositivos PDMS, una serie de genes sintéticos se microarrayed sobre sustratos de vidrio recubierto con resina epoxi (CEL Associates). (F) El dispositivo está entonces alineado con el microarray de ADN atrapando los &quot;genes sintéticos&quot; dentro de las cámaras de ADN. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Una foto de los dispositivos PING. (A) El dispositivo consist alineados de dos capas de PDMS (control y flujo). La capa de flujo de trabajo paralelos contiene ADN y reacción (gris) controlados por válvulas micromecánicos (&quot;button&quot;, &quot;pan&quot; y &quot;cuello&quot;) en la capa de control. (B) Las capas están alineadas a un microarray impreso, que los programas de cada cámara de ADN con un solo punto. Esto elimina cualquier contaminación potencial. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imágenes fluorescentes de una matriz de proteína creada con un chip de microfluidos. Los genes planas impresas se expresaron a proteínas dentro del dispositivo (en la cámara de ADN) y se tira hacia abajo a la superficie (por debajo de la &quot;botón&quot; de la válvula en la cámara de reacción) a través de su C-terminal de His. Expresión de la proteína se detectó mediante su C-myc N-terminal de etiqueta y un anticuerpo fluorescente específico. Las distintas intensidades de señal indican diferentes niveles de expresión de proteínas. Un-manchado cámaras sirvieron como controles para el fondo leVels.

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	<li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+column:+Microfluidic+high-throughput+screening.">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li><li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanoliter+systems.">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li><li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks.">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li><li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis.">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li><li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis.">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li><li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li><li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li><li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li><li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supports+for+microarray+immunoassays.">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li><li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B.">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428 (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este trabajo se presenta un método para la generación de matrices de proteínas de alto rendimiento mediante una plataforma de microfluidos. La generación de matriz se basa en la impresión de microarrays de plantillas de ADN y en la expresión de proteínas in vitro a partir del ADN dentro del dispositivo de microfluidos. Nuestra plataforma de microfluidos novela tiene varias ventajas importantes sobre los métodos actualmente utilizados, que lo convierten en una her...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> Dow Corning EE.UU. </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Clorotrimetilsilano (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Sustratos de vidrio recubiertos con epoxi </td><td> CEL Asociados EE.UU. </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> Poli etilen glicol (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-trehalosa dihidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinilado-BSA </td><td> Atravesar </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidina </td><td> Atravesar </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> penta-His-biotina </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Biological Industries</a> </td><td> 03-025-1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc anticuerpo Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Caja de control </td><td> Stanford microfluídica Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Molde </td><td> Stanford microfluídica Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Pin </td><td> Nueva Inglaterra pequeños tubos Corporación </td><td></td></tr><tr><td> Tygon microbore tubería </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Microarrayer </td><td> Bio Robótica </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> Pins de silicona </td><td> Paralelo Syntesis </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

high-throughput protein expression generator using a microfluidic platform

Campos en rápido crecimiento, tales como la biología de sistemas, requieren el desarrollo y la implementación de nuevas tecnologías, lo que permite mediciones de alto rendimiento y alta fidelidad de los grandes sistemas. Microfluídica se compromete a cumplir muchos de estos requisitos, tales como la realización de experimentos de alto rendimiento de cribado en el chip, que abarca ensayos bioquímicos, biofísicos y basados ​​en células-1. Desde los primeros días de los dispositivos de microfluidos, este campo ha evolucionado drásticamente, lo que lleva al desarrollo de microfluidos integración a gran escala 2,3. Esta tecnología permite la integración de miles de válvulas micromecánicos en un único dispositivo con una huella de franqueo de tamaño (Figura 1). Hemos desarrollado una plataforma microfluídica de alto rendimiento para la generación de la expresión in vitro de matrices de proteínas (Figura 2) con nombre PING (interacción proteína Generador de red). Estas matrices pueden servir como una plantilla para muchos experimentostales como la proteína-proteína 4, proteína-ARN 5 o proteína de ADN 6 interacciones. El dispositivo consiste de miles de cámaras de reacción, que están programados individualmente utilizando una microarrayer. Alineación de estos microarrays impresos a los dispositivos de microfluidos programas de cada cámara con una sola mancha eliminación de la contaminación potencial de reactividad cruzada o más, para generar micromatrices utilizando técnicas estándar de microarrays manchado es también muy modular, lo que permite la arraying de proteínas, ADN 7 8, moléculas pequeñas, e incluso suspensiones coloidales. El impacto potencial de la microfluídica en las ciencias biológicas es importante. Una serie de ensayos basados ​​en microfluídica ya han proporcionado nuevos conocimientos sobre la estructura y función de los sistemas biológicos, y el campo de la microfluídica, seguirá afectando la biología.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Se presenta un enfoque de microfluidos para la expresión de matrices de proteínas. El dispositivo consiste en miles de cámaras de reacción controladas por micro-mecánicos válvulas. El dispositivo microfluídico está acoplado a una biblioteca de genes de microarrays-impreso. Estos genes se transcribe y se traduce en un chip, lo que resulta en una matriz de proteína listo para su uso experimental.

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K vistas.  Bar-Ilan University. Se presenta un enfoque de microfluidos para la expresión de matrices de proteínas. El dispositivo consiste en miles de cámaras de reacción controladas por micro-mecánicos válvulas. El dispositivo microfluídico está acoplado a una biblioteca de genes de microarrays-impreso. Estos genes se transcribe y se traduce en un chip, lo que resulta en una matriz de proteína listo para su uso experimental.

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Investigación

Bioingeniería

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

El uso de un gran procesamiento<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una plataforma de microfluidos para la proyección de imagen Longitudinal en Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Una plataforma microfluídica multicapa para la conducción de la expresión génica sin células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...