La generación de emigrantes timicos derivados de iPSC por un cultivo de órganos timicos 3D es el primer método in vivo que regenera la población homogénea de células T ingenuas específicas del antígeno tumoral. Las principales ventajas son que los iTE son más relevantes fisiológicos, y este método es más potente que cualquier otro método diferencial in vivo para producir constantemente una célula T específica. iTE es un malestar homogéneo de las células T específicas de CD8 alfa-beta con un fenotipo funcional similar a un célula T ingenuo, incluida la capacidad de proliferación, la remodiforma y la supresión tumoral in vivo.
Demostrando el procedimiento será el Doctor Rafiqul Islam un post-doc en mi laboratorio. Para comenzar la referencia cultural de las celdas OP9/DLL1 en medios OP9 a 37 grados Celsius. Cuando las células alcancen el 80 al 95 por ciento de confluencia, lávelas una vez con un PBS libre de magnesio X, calcio y fenol.
Agregue cuatro mililitros de punto cero cinco por ciento de trippsina e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego agregue cuatro mililitros de medios y pipetas OP9 para desasociar la capa celular y hacer una suspensión de una sola celda. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros a través de un colador celular de 100 micrómetros.
Centrifugar a 300 G y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspirar la supuración y volver a suspender las células en 12 mililitros de medios OP9. A continuación, plato de dos mililitros de la suspensión celular OP9/DLL1 en un nuevo cultivo celular de 10 centímetros de placa Petri.
Agregue ocho mililitros adicionales de medios OP9. Repite este pasaje cada dos o tres días. En el día cero cosecha las células madre pluripotentes inducidas como una suspensión de una sola célula por trippsinación.
Recoger las células y centrifugar a 300 G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender los IPC a una densidad de 100.000 células por cada 10 mililitros de medios OP9. Luego plancha 100.000 células en un confluente plato OP9/DLL1 de 10 centímetros.
Continúe la incubación a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono. En el tercer día aspirar los medios antiguos y reemplazarlo con 10 mililitros de medios frescos OP9. En el día seis lave cada plato OP9 confluente de 10 centímetros con 10 mililitros de PBS.
Agregue tres mililitros de punto cero cinco por ciento de trippsina a cada plato. E incubar durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue cuatro mililitros de medios OP9 y pipetee suavemente para recoger las células.
Pasar las células a través de un colador celular de 100 micrómetros y centrífuga a 300 G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, deseche el sobrenadante. Re-suspenda las células en 10 mililitros de medios de diferenciación.
Articule la suspensión celular en un nuevo plato confluente OP9/DLL1 de 10 centímetros. Continúe la incubación a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono. En el día nueve, aspirar los medios antiguos y reemplazarlo con 10 mililitros de medios de diferenciación frescos.
Continúe incubando las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2. En el día 11, cuando se observan cardiomiocitos en colonias iPSC, las pipetas utilizan una pipeta para separar mecánicamente las células no adherentes. Filtrar las células a través de un colador celular de 100 micrómetros y centrífuga a 300 G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Después de esto, aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 24 mililitros de medios de diferenciación. Placa el iPSC en un confluente OP9/DLL1 placa de seis pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono.
El día 15, recoja todas las células no adherentes y filtre a través de un colador celular de 40 micrómetros. Centrifugar a 300 G y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Continúe transmitiendo las celdas no adherentes cada tres o cuatro días como se describió anteriormente.
En el séptimo día del tratamiento DGWO, saque cuatro nuevos platos de 10 centímetros. Llene cada plato con 20 mililitros de medios completos. Transfiera todas las membranas de nitrocelulosa con lóbulos timicos en una placa de 10 centímetros.
Usando fórceps, separe los lóbulos individuales de la membrana permitiendo que se sumerjan en medios. Incubar los lóbulos durante una hora a temperatura ambiente. Luego transfiera los lóbulos timicos a un nuevo plato de 10 centímetros con medios completos.
E incubar durante una hora a temperatura ambiente. Repita esta transferencia e incubación dos veces más. Usando fórceps, fija los lóbulos timicos al plato mientras usas la otra mano para hacer una incisión de 100 a 200 micras de profundidad en el centro y extendiendo la mitad del diámetro del lóbulo para facilitar la migración del progenitor de células T en el lóbulo.
Transfiera los lóbulos timicos a un nuevo plato de 10 centímetros lleno de medios de diferenciación completos. Si utiliza placas de cultivo 3D con rejillas de nivel inferior y superior, llene ambas rejillas con PPS esterilizado para evitar la evaporación y el secado de las gotas colgantes. A continuación, transfiera 30 microlitros de medios completos que contengan un lóbulo timático tratado DGWO en cada pozo de la placa de cultivo 3D.
Recoja las celdas de linaje T no adherentes de la co-cultivo OP9/DLL1. Y vuelva a suspender las células con una densidad de 2.000 a 5.000 células linajes de células T por cada 20 microlitros de medios. Agregue 20 microlitros de la suspensión de la célula del linaje T a cada lóbulo timico en la placa de cultivo 3D.
Incubar durante la noche a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono. Al día siguiente, ajuste la pipeta P200 a 30 microlitros. Pipetear los medios en cada pozo arriba y abajo varias veces para eliminar todas las células que rodean los lóbulos timicos.
A continuación, aspirar los medios de cada pozo y reemplazarlo de 30 microlitros de medios completos. Repita este proceso, canalizando, quitando y reemplazando el medio de cinco a siete veces para eliminar las células T inmaduras adicionales que no migren a los lóbulos. Continúe incubando los lóbulos, asegurándose de cambiar de 25 a 30 microlitros de medios al día.
En el cuarto o cinco días, utilice microscopía ligera para confirmar la formación de un halo de emigrantes timicos derivados del iPSC alrededor de los lóbulos. Recoger el iTE diariamente mediante la canalización de medios sin interrupción del lóbulo. Cambie los medios todos los días y continúe la colección hasta aproximadamente 12 días.
Los iTE cosechados están listos para usarse para análisis moleculares o experimentos de trasplante in vivo. En este estudio, los timos fetales co-cultivados se seccionan para analizar si las células de linaje de células T derivadas de iPSC pueden migrar a los lóbulos timicos. Los lóbulos de control sin semillas tienen una arquitectura de tejido caracterizada por una red epitelial timica similar a un astrocito desplegada de células positivas CD3 endógenas.
Sin embargo, los lóbulos timicos sembrados con células T inmaduras derivadas de iPSC se repoblan con células mononucleares positivas CD3 que indican la migración de células T inmaduras derivadas de iPSC a los lóbulos. Células T que migran hacia, y maduran, dentro del microambiente timico posteriormente se egresan como iTE. El análisis citométrico de flujo se utiliza entonces para probar la caracterización fenotípica de varias células.
Las células T timicas adicionales muestran células T CD4, CD8 doble positivas y células T alfa monopositivas CD8 sin expresión del marcador de selección positivo, MHC Clase Uno, mientras que iTE son una población homogénea de fenotipo de células T T positivos CD8 alfa clase uno que indica su paso exitoso a través de la selección positiva antes de la salida del lóbulo timico. iTE tienen antígeno-especificidad contra el péptido cogntado. iTE co-cultivado con antígeno que presenta células precargadas con un péptido irrelevante como nucleoproteína no se muestran en una producción celular de citoquinas.
Sin embargo iTE co-cultivo antígeno que presenta células pre-pulsadas con péptido cognado GP100, producen intracelularmente TNF alfa interleucina ii e interferón gamma. Recuerde que el cultivo de células de línea abierta depende en gran medida de la ranura ABS. El iTE generado se puede utilizar en cualquier otro ensayo que trabaje con células T convencionales.
Por ejemplo, ensayo de eliminación de células T, ensayo de producción de citoquinas, ensayos de regresión tumoral in vivo, estudio de diferenciación de células T, etc. Esta tecnología se puede aplicar a muchos proyectos inmunológicos o de este tipo. Incluyendo una diferenciación de células T, la maduración de la célula T de sincronización del pulso y la generación de células T específicas del antígeno a partir de progenitor de hematocrito o células madre.
Después de ver este video, el espectador debe entender cómo generar emigrantes timicos específicos de antígeno tumoral inducidos, derivados de células madre, utilizando un sistema de cultivo de órganos timicos 3D.
