Los esferoides tumorales tridimensionales pueden imitar las propiedades específicas de los tejidos de los tumores in vivo, proporcionando datos más relevantes clínicamente para el descubrimiento de fármacos contra el cáncer que el simple cultivo celular 2D. Nuestra técnica de imagen, la tomografía de coherencia óptica, puede visualizar fácilmente la estructura 3D de un solo nervio tumoral, con un tamaño de varios cientos de micras, y proporcionar una caracterización más precisa de su morfología y infestación de trabajo, a menudo en pocos segundos. Usando el modelo esférico 3D podemos potencialmente acortar la línea de tiempo del descubrimiento de fármacos, reducir los costos y llevar nuevos medicamentos a los pacientes de manera más efectiva.
Formar la forma esférica del cúmulo tumoral es un paso crítico en nuestro experimento. Es importante elegir la placa de fijación ultrabaja correcta con la parte inferior redonda, y la velocidad de centrifugación adecuada después de la siembra de la célula. Comience este experimento cultivando células de interés en un matraz de cultivo como se describe en el manuscrito.
Mantener las células en una incubadora bajo condiciones estándar, y monitorear su estado de salud todos los días. Actualice los medios según sea necesario. Para realizar el cultivo celular 3D en placas de varios pozos, primero retire el medio del matraz de cultivo celular y lave las células con PBS precale calentado de 33 grados Celsius esterilizados.
Luego agregue un mililitro de Trypsin-EDTA para resuspender las células e incubar durante tres minutos a 37 grados Centígrados. Añadir tres mililitros de medio de cultivo para diluir el Trypsin. Transfiera esta suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros, y centrifugar a 500G y temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular con cuatro mililitros de medio de cultivo precalentado. Para determinar la concentración celular, hipat una gota de muestra en un hemocitomekil, y contar las células. Diluir hasta la concentración de siembra deseada.
Semilla 200 microlitros de suspensión celular en cada pozo de un accesorio ultra bajo, placa multi-pozo de fondo redondo, a una concentración de 3.000 células por mililitro, para lograr alrededor de 600 células por pozo. Inmediatamente después de la siembra, centrifugar toda la placa a la velocidad más baja disponible, a temperatura ambiente, durante siete minutos. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y 5%Co2, asegurándose de refrescar el medio cada tres días.
En primer lugar, construya el brazo de referencia y el brazo de muestra del sistema OCT, siguiendo los esquemas de este manuscrito. A continuación, construya el espectrómetro, incluyendo un kilómetro, una explanación, una lente F-Theta y una cámara de escaneo de línea. Utilice un adaptador de placa para sujetar la placa multi-pozo en una posición fija.
Antes de la toma de imágenes, corrija la inclinación y rotación de la placa multi-pozo utilizando una etapa de inclinación 2D, y una etapa de rotación montada en la etapa de transición para minimizar la variación del plano focal de diferentes pozos. A continuación, ajuste la rotación para asegurarse de que los bordes de la placa son paralelos a la dirección del movimiento de la etapa, de modo que los pozos permanezcan en las mismas posiciones horizontales en las imágenes OCT. A continuación, ajuste la etapa de inclinación para asegurarse de que la placa es paralela a la mesa óptica, de modo que los pozos permanezcan en las mismas ubicaciones verticales para la imagen.
El día de la toma de imágenes de esferoides tumorales, retire la placa de varios pozos de la incubadora. Transfiéralo bajo el sistema de imágenes OCT y colóquelo en el adaptador de placa. Para ajustar la altura de la placa, muévala a lo largo de la dirección Z de la etapa de traslación.
En el software de imágenes personalizado, establezca un rango de exploración OCT deseado para cubrir todo el esferoide tumoral, dependiendo de sus etapas de desarrollo, y haga clic en Guardar parámetros para guardar la configuración. A continuación, muestre las vistas previas optimizadas XZ y YZ OCT de los esferoides tumorales. Adquiera imágenes oct 3D de esferoides tumorales uno por uno para todos los pozos de la placa que contienen esferoides.
Para ver la imagen de vista previa, haga clic en el botón de vista previa. Y para adquirir la imagen OCT, haga clic en el botón adquirir. Registre el proceso general de movimiento de etapa de adquisición de datos OCT.
Para garantizar la calidad de imagen óptima para todos los esferoides tumorales, el adaptador de placa debe ajustarse con precisión y el volumen medio debe ser el mismo. Utilice un código de procesamiento de C+ personalizado para procesar conjuntos de datos OCT 3D de esferoides tumorales para generar imágenes estructurales OCT. Utilice imágenes OCT 2D en tres planos transversales, XY, XZ e YZ a través del centroide del esferoide para generar el collage de imágenes esferoides.
Para obtener la representación 3D del esferoide utilizando el software deseado, primero cargue los datos SD OCT en el software. Haga clic en el panel superar, luego agregue un nuevo volumen y elija el modo de fusión que se utilizará para la representación 3D. Para ajustar el ángulo de visión, utilice el puntero del ratón para arrastrar la imagen y continuar con la cuantificación como se describe en el manuscrito.
A partir de los datos procesados se generó un collage de imágenes OCT no desfasadas de esferoides de línea celular HCT116, con resultados comparables con imágenes de otros sistemas de imágenes 2D de alto rendimiento. Además, se generó el collage de imágenes esferoides transversales 2D de 96 pozos para monitorear las alturas del esferoide, y visualizar la inhomogeneidad del esferoide en la dirección vertical. Un collage de imágenes esferoides renderizadas en 3D se puede generar desde cualquier ángulo predefinido para visualizar la forma 3D general y evaluar la redondez del esferoide.
Después del postprocesamiento general de PTU, se han obtenido imágenes estructurales 3D OCT de un esferoide tumoral. A partir de los datos de PTU, se generó un poste de superficie 3D y cortes ortogonales XZ, YZ y XY para visualizar la estructura del esferoide tumoral en cualquier dirección. Se realizó un monitoreo longitudinal de un solo esferoide tumoral para caracterizar su diámetro, altura y volumen basado en vóxeles, generando las curvas de crecimiento en tamaño y volumen durante el desarrollo de 21 días.
Aquí, el esferoide se interrumpió el día 11, y se derrumbó por completo el día 21. El rastreo longitudinal mostró el aumento de las áreas de células muertas en el esferoide tumoral. Las imágenes renderizadas en 3D del esferoide tumoral mostraron la apariencia y el crecimiento de las regiones de células muertas desde el día siete hasta el día 14, como se muestra en el aumento de las áreas necróticas resaltadas en rojo.
A medida que aumentaba el porcentaje de las áreas necróticas, el esferoide tumoral no podía mantener su forma perfecta, y por lo tanto colapsó. Con esta plataforma de imágenes podemos explorar aún más otros modelos complejos de esferas tumorales, como el modelo de imágenes 3D, el vasto modelo de criatura y los modelos de cultivo en co-cultivo para simular mejor los tumores in vivo. Nuestro sistema de imágenes OCT de alto rendimiento puede proporcionar un enfoque alterativo para la detección de drogas en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer.
Esto también se caracteriza, muestras biofabricadas 3D para diversas aplicaciones biomédicas.
