Este protocolo demuestra la expresión y purificación de anticuerpos y la monitorización en tiempo real de la distribución de anticuerpos en tumores y tejidos. Los anticuerpos de detección con el protocolo descrito ayudarán a seleccionar anticuerpos que tienen una distribución limitada de tejido no específico y enriquecerán las localizaciones tumorales. La técnica descrita es rápida y rentable.
Otras técnicas, como la tomografía computarizada por emisión de un solo fotón y la tomografía por emisión de positrones, son muy costosas y requieren trazadores radiactivos y otros trazadores sofisticados. La técnica no se limita a los anticuerpos dirigidos al cáncer. Se puede aplicar a cualquier otra enfermedad, como enfermedades pulmonares o cardíacas, para el análisis de la distribución de anticuerpos en el cuerpo.
Demostrando el procedimiento, estará Jeremy Gatesman, un técnico veterinario de mi universidad. Células CHO crudas en 200 mililitros de medios, en delong, Erlenmeyer desconcertado matraces. Combine cinco mililitros de medios de estilo libre CHO con 50 microgramos de ADN de clon pesado variable y 75 microgramos de ADN de clon ligero variable en un tubo de 15 mililitros.
Luego, vórtice el tubo. Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añadir 750 microlitros de un miligramo por mililitro de polietilenimina a la solución de ADN, y vórtice agresivamente durante 30 segundos.
Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos adicionales. Agregue toda la mezcla a las células CHO mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente las células a 37 grados centígrados mientras se agita a 130 RPM.
Al día siguiente, agregue dos mililitros de agente anti-clumping de 100 X y dos mililitros de solución antibacteriana antimicótica a las células. Incubar los matraces a 32 a 34 grados celsius, con agitación a 130 RPM. Continúe cultivando las células durante 10 a 11 días, añadiendo 10 mililitros de alimento de triptona N1, y dos mililitros de suplemento de 100 X glutamina en cada quinto día.
Cuente las células cada tercer día para asegurarse de que la viabilidad celular se mantenga por encima del 80% En el día 10 u 11, cosechar el medio para la purificación de anticuerpos centrifugando el cultivo a 3000 veces G, y grados cuatro Celsius durante 40 a 60 minutos. A continuación, filtre el medio transparente con un filtro de botella de 0,22 micrómetros. Para purificar los anticuerpos, equilibre la columna de proteína A con dos volúmenes de columna de tampón de unión.
Pase el medio filtrado a través de la columna a un caudal de un mililitro por minuto. A continuación, lave la columna con dos volúmenes de columna de búfer de enlace. Utilice cinco mililitros de tampón de elución para eluir el anticuerpo en 500 fracciones de microlitro.
Y neutralice el pH del anticuerpo aludido añadiendo 10 microlitros de tampón de neutralización para fracción. Mida la concentración del anticuerpo purificado con un espectrofotómetro utilizando el protocolo predeterminado para IgG. Dialyze 0,5 mililitros del anticuerpo utilizando un casete de diálisis en un litro de tampón de conjugación.
Después de cuatro horas, transfiera el cassette de diálisis a un tampón fresco y dialyze durante la noche. Para configurar una reacción de conjugación, agregue 0,03 microgramos de tinte IRR 800 CWU por un miligramo de anticuerpo en un volumen total de 500 microlitros. Incubar la mezcla durante dos horas a 20 grados centígrados, luego purificar los conjugados etiquetados por diálisis extensa contra PBS.
Estimar el grado de etiquetado midiendo la absorbancia del tinte 780 nanómetros, y la absorbancia de la proteína a 280 nanómetros. Para desarrollar xenogramas de ratón, levante suavemente la piel del animal y sepárela de la capa muscular subyacente. Inyecte lentamente 100 microlitros de suspensión celular debajo de la piel con una aguja de calibre 26.
Espere unos segundos antes de sacar la aguja para que el medio de matriz del sótano informe la estructura semisólida similar al gel junto con las células debajo de la piel, lo que evitará que la mezcla salga del lugar de inyección. Para realizar imágenes in vivo, inyecte el anticuerpo etiquetado con el tinte a través de la vena de la cola. Después de anestesiar el ratón, compruebe la falta de respuesta a los reflejos del pedal y dilate la vena aplicando agua tibia.
Utilice una jeringa de insulina de 1 cc con una aguja de calibre 26 para inyectar 25 microgramos del anticuerpo etiquetado en un volumen de 100 microlitros. Como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo isotipo IgG no específico que no se dirige a las células cancerosas. Realizar imágenes in vivo ocho, 24 y 48 horas después de las inyecciones de anticuerpos.
En el software de imágenes, haga clic en inicializar. Confirme que la temperatura de la etapa es de 37 grados centígrados. En el panel de control, configure imágenes de fluorescencia a través del asistente de imágenes y ajuste la excitación a 773 nanómetros, emisión a 792 nanómetros.
Transfiera el ratón anestesiado a la cámara de imágenes. Colóquelo en el campo de imagen usando el cono nasal. Cuando esté listo, haga clic en adquirir en el panel de control para la adquisición de imágenes y haga clic en exponer automáticamente.
La imagen generada es la superposición de la fluorescencia en la imagen fotográfica con fluorescencia óptica y densidad mostrada en unidades de recuentos o fotones. Se confirmaron clones positivos de ADNs con dominios de luz variable pesada y variable con PCR de colonia. Los resultados representativos de la ejecución de farletuzumab purificado en la página SDS no reductora y reductora se muestran aquí.
Las cadenas pesadas y ligeras producían bandas de 50 y 25 kilodalton después de la reducción. También se confirmó la unión de anticuerpos a proteínas nativas en la superficie celular. Los anticuerpos con etiqueta fluorescente fueron inyectados en venas de cola, en ratones injertados con tumores completos de R1 que expresan tumores.
Los animales se vivieron imagen en varios puntos de tiempo utilizando IVIS. el enriquecimiento selectivo de los inhibidores de datos de anticuerpos completos R1 y BaCa en los tumores. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que el mantenimiento de las células CHO es fundamental para el rendimiento de anticuerpos.
Y es importante tener un grado similar de conjugación de tinte fluorescente para la localización de tumores competitivos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica de tejidos y el ELISA específico de tejidos o tumores para apoyar los datos de imágenes de ratones vivos.
