Como ya sabemos, el microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento y la invasión del cáncer. Para imitar la progresión del carcinoma, necesitamos una matriz tumoral humana biológicamente relevante. Este es el único ensayo de invasión in vitro basado en la matriz tumoral humana.
En comparación con el ensayo esferoide clásico, este método no es tan sensible a la temperatura y no requiere transferencia de esferoide. Esta técnica es adecuada para muestras de cáncer sólido derivadas del paciente, como el carcinoma de cabeza y cuello, y puede extenderse hacia la medicina personalizada, incluidas las terapias de quimiodiación. Esta matriz basada en tumores humanos ya se ha utilizado para varias aplicaciones, incluyendo pruebas de fármacos de alto rendimiento, análisis de células vivas, cicatrización de heridas y ensayos de transferencia.
El paso más técnicamente sensible es el manejo del método del fibrinógeno se agrega por lo que es posible que desee primero practicar este paso con pozos vacíos. Es importante mostrar el manejo adecuado de la matriz y es fácil de analizar mostrando el método visualmente. Para la generación de esferoides tumorales multicelulares, dispensar una vez 10 a las terceras células de la línea celular de interés en 50 microlitros de medio completo en cada pozo de una placa de fondo redondo de unión ultra-baja de 96 pozos.
A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5% de carbono durante cuatro días antes de confirmar visualmente la formación de esferoides tumorales con un microscopio invertido. Para establecer un ensayo de invasión de esferoides tridimensional, descongele la matriz derivada del mioma humano sobre el hielo y descongele la solución de stock de fibrinógenos en un baño de agua de 37 grados centígrados. Cuando los reactivos se hayan calentado, mezcle los volúmenes apropiados de matriz completa derivada del mioma humano, trombina, aprotinina y fibrinógeno, añadiendo el fibrinógeno justo antes de dispensar la mezcla de matriz en las células.
Añadir inmediatamente 50 microlitros del gel resultante en cada pozo de la placa de cultivo de esferoides, dirigiendo la punta hacia la pared interior de cada pozo y pipeteando la ralentización sin mover el esferoide desde el centro del pozo. Dado que el fibrinógeno comienza a gel después de unos minutos, requiere un pipeteo inverso robusto pero preciso y el tratamiento de sólo unos pocos pozos a la vez. Devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos para permitir que el gel de fibrina de matriz derivada del mioma humano se solidifique antes de agregar suavemente 100 microlitros de medio completo a la parte superior de cada gel.
A continuación, imagine la invasión esferoide diariamente. Para la segmentación de imágenes con ilastik, abra el software de clasificación y segmentación de imágenes de código abierto y seleccione Flujo de trabajo de clasificación de píxeles. Guarde el proyecto ilastik en el equipo.
Los píxeles se clasificarán en función de las anotaciones realizadas por el usuario. Haga clic en Datos de entrada y Agregar nuevo para seleccionar imágenes para el análisis. Para la selección de operaciones, haga clic en Selección de operaciones y Seleccionar operaciones.
Haga clic en los cuadros correspondientes para seleccionar las características de interés. Los cuadros seleccionados se volverán verdes. Para un entrenamiento, haga clic en Entrenamiento.
En la sección Entrenamiento, debe haber dos etiquetas, Etiqueta 1 y Etiqueta 2. Marque el fondo con una de las etiquetas y marque las celdas con la otra etiqueta. Cuando se hayan etiquetado todas las celdas y el fondo de la primera imagen, seleccione la siguiente imagen de la vista actual para continuar marcando las celdas y el fondo hasta que se haya marcado el 10% de las imágenes.
A continuación, seleccione Live Update para analizar todas las imágenes. Cuando se haya completado el entrenamiento y ilastik haya analizado todas las imágenes, haga clic en Predicción de exportación y seleccione Segmentación simple desde origen. A continuación, seleccione el formato de archivo de salida deseado en Elegir configuración de imagen de exportación y haga clic en Exportar todo para exportar los resultados del etiquetado.
Los archivos se exportarán a la misma carpeta con las imágenes originales. Para el análisis de área, abra primero la imagen original con una barra de escala en Fiji ImageJ, teniendo cuidado de que la imagen tenga el mismo tamaño y dimensión que las imágenes analizadas. Utilice la herramienta de selección de líneas para dibujar una línea de una longitud conocida y haga clic en Analizar y establecer escala.
A continuación, establezca la distancia conocida en el campo Distancia conocida. Establezca la unidad adecuada y haga clic en Global. Para instalar el complemento ilastik, haga clic en Ayuda y actualización y haga clic en Administrar sitios de actualización en la ventana del actualizador de ImageJ.
Haga clic junto a ilastik, Cerrar y Aplicar cambios. Después de varios minutos, aparecerá una ventana de información que dice que se ha actualizado correctamente. Haga clic en Aceptar y reinicie ImageJ.
A continuación, haga clic en Plugins, Macros e Instalar y seleccione el contador. archivo ijm. A continuación, haga clic en Abrir.
Para completar el análisis de área, haga clic en Plugins y desplácese para seleccionar ilastik. Seleccione Importar HDF5 y seleccione el archivo con el formato h5. Haga clic en Abrir y cargar y aplique la tabla de búsqueda.
A continuación, haga clic en el botón A en el teclado y el área aparecerá en la ventana de resumen como el área total. En este experimento representativo, cuatro días después de la siembra de la línea de carcinoma de células escamosas laringe metastásica, se añadió matriz a los esferoides formados como se demostró y la invasión fue monitoreada diariamente en un microscopio invertido. Una vez incrustadas, las células de la matriz de fibrina derivada del mioma humano comenzaron a invadir rápidamente después de un día y se extendieron a la matriz durante los dos días siguientes.
Las células de la matriz derivada del sarcoma del ratón no invadieron la matriz circundante, sino que formaron una estructura asimétrica. Las células del colágeno invadieron ligeramente, pero debido a la contracción de la matriz el análisis se volvió difícil. En algunos pozos, los esferoides incluso desaparecieron después de tres días.
Aquí, se muestra la cuantificación de la invasión de una célula de carcinoma de células escamosas laríngeas primarias y metastásicas en la matriz de fibrina derivada del mioma humano. El análisis de células vivas de la invasión esferoide de matriz de fibrina derivada de mioma humano revela el movimiento celular en hebras a lo largo de la matriz que es seguido por otras células con el tiempo. Recuerde tener cuidado de no mover el esferoide desde la posición central al agregar la matriz a los pozos.
Este procedimiento se puede utilizar para estudiar cómo la irradiación y moléculas específicas como los medicamentos contra el cáncer afectan la invasión. Las células se pueden fijar y teñir para estudios posteriores. En el modelo clásico de sarcoma de ratón, las células proliferan principalmente y el aspecto de invasión es mínimo.
Esta matriz basada en tumores humanos induce la invasión, haciendo que los estudios de inhibición sean más eficientes.
