La nanoprecipitación flash, o técnicas FNP que se muestran aquí ofrecen una plataforma escalable y directa para encapsular compuestos hidrófobos o hidrófilos dentro de nanopartículas poliméricas. Para mayor claridad, la técnica utilizada para encapsular los productos biológicos se denomina nanoprecipitación de flash inversa, o IFNP. Los principios subyacentes no cambian, pero la estructura de nanopartículas resultante es diferente.
Por lo general, los nuevos usuarios necesitan práctica para operar constantemente las jeringas de entrada cuando realizan manualmente pequeños lotes de nanopartículas. Los volúmenes más grandes se pueden producir con bombas de jeringa controladas por computadora. Nuestro protocolo también proporciona detalles sobre el postprocesamiento de soluciones de nanopartículas, que a menudo es crítico para la aplicación exitosa de una formulación.
Antes de iniciar el proceso, compruebe los accesorios del mezclador CIJ y asegúrese de que el tubo de salida no esté engarzado. A continuación, llene dos jeringas Luer libres de goma de polipropileno de cinco mililitros con dos o tres mililitros de acetona u otro disolvente de limpieza. Fije las jeringas en los adaptadores de entrada y ajuste el conjunto sobre un contenedor de residuos.
Presione firmemente los émbolos para enviar el disolvente a través de la cámara de mezcla en el transcurso de unos segundos. A continuación, retire las jeringas y seque la mezcla con una corriente de gas nitrógeno. A continuación, para comenzar a preparar el flujo de entrada de disolvente, pipetear 0,25 mililitros de una solución de 10 miligramos por mililitro de vitamina E, en tetrahidrofurano libre de estabilizador, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
A continuación, pipetear 0,25 mililitros de una solución de 10 miligramos por mililitro de un estabilizador de copolímero de bloque en THF en el mismo tubo. Vórtice la mezcla durante cinco a 10 segundos, y luego centrifugarlo a mil G durante cinco a 10 segundos para recuperar el líquido adheriendo a la tapa. Preparar un tubo centrífugo de 1,5 mililitros que contenga 0,525 mililitros de agua desionizada como anti-solvente.
Luego, pipetear cuatro mililitros de agua desionizada en un vial de centelleo de 20 mililitros para hacer el baño de enfriamiento. Coloque una pequeña barra de agitación en el vial. Coloque el mezclador CIJ limpio sobre el baño de enfriamiento en un bastidor o bloque de tubo de ensayo en una placa de agitación.
Comience a agitar el baño de enfriamiento a aproximadamente el 75% de la velocidad máxima posible. A continuación, coloque una aguja con punta contundente en una jeringa libre de goma de polipropileno de un mililitro y extraiga el anti-solvente. Expulse cuidadosamente las burbujas de aire de la jeringa y, a continuación, retire y deseche la aguja.
Ajuste el émbolo para que el líquido llegue justo al final de la jeringa. A continuación, conecte la jeringa a una de las entradas CIJ. Dibuje la mezcla de disolvente en una segunda jeringa de la misma manera y adjúntela a la otra entrada.
Para formar las nanopartículas, presione simultáneamente ambos émbolos con un movimiento uniforme suave en menos de 0,5 segundos. Es fundamental deprimir las jeringas de forma rápida, uniforme y sin problemas. No debe golpear de repente las jeringas, pero debe comenzar el movimiento ya en contacto con la parte superior de las jeringas.
Después, ajuste el mezclador CIJ sobre el contenedor de residuos, sin quitar las jeringas para asegurarse de que el volumen de retención no drene en la dispersión. Retire la barra de agitación del vial de centelleo y colóquela. A continuación, retire y deseche las jeringas de disolvente y antisós solventes.
Limpie el mezclador antes del siguiente ensayo de nanoprecipitación de flash. Para preparar una muestra para el análisis dinámico de dispersión de luz, pipetear 100 microlitros de la dispersión en una cubeta. Añadir 900 microlitros de disolvente de baño de enfriamiento, y mezclar bien por pipeteo antes de iniciar el análisis de la muestra.
Para comenzar a ensamblar el micro MIVM, coloque la junta tórica en el disco de geometría de mezcla. Alinee los orificios del disco de mezcla con las clavijas del disco superior y únalos, teniendo cuidado de no desplazar la junta tórica. Afloje el accesorio de tubo de salida en el receptor inferior y, a continuación, atornille los discos conectados en el receptor.
Coloque una llave inglesa en las clavijas del disco superior y apriete el conjunto. Apriete el accesorio de la tubería de salida para que se siente firmemente contra la cara inferior del disco de geometría de mezcla. Asegúrese de que los accesorios de la jeringa del disco superior estén ajustados.
Levante la placa móvil en el soporte de la mezcladora para mantenerla fuera del camino, luego coloque la mezcladora montada en el soporte, con el tubo de salida roscado a través de la placa de soporte. A continuación, coloque un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga 5,25 mililitros de cloroformo como baño de enfriamiento debajo del tubo de salida. A continuación, dibujar 0,75 mililitros de solución A, que es una solución de cinco miligramos por mililitro de ovalbumina en dimetil sulfóxido en 10% agua en volumen, en una jeringa de bloqueo Luer hermética de un mililitro de gas con una aguja con punta contundente.
Expulse cuidadosamente las burbujas de aire, retire la aguja y retire la solución hasta el final del accesorio Luer. Conecte la jeringa a una entrada de mezclador. Repita este proceso con 0,75 mililitros cada uno de la solución B, que es de seis miligramos por mililitro de estabilizador de copolímero de bloque en DMSO, y la solución C, que es THF.
Conecte las jeringas a las entradas del mezclador en el sentido de las agujas del reloj, en orden alfabético. Prepare una jeringa hermética de gas de 2,5 mililitros que contenga 1,85 mililitros de solución D, que es cloroformo, y conéctela a la cuarta entrada. Confirme que no hay ninguna diferencia significativa en las alturas de la jeringa.
A continuación, agarre cuidadosamente la carcasa del rodamiento a cada lado de la placa móvil y baje lentamente la placa hasta que apenas esté descansando uniformemente encima de las jeringas. Para generar las nanopartículas, presione la placa de forma constante y suave en aproximadamente 0,5 a un segundo. A continuación, retire y tape el tubo de baño.
Desmonte y limpie el mezclador cuando haya terminado. Para trabajar con volúmenes más grandes, cargue las soluciones en jeringas herméticas a gas y conecte tubos de politetrafluoroetileno con accesorios Luer a las jeringas. Prime las soluciones a los extremos de la tubería.
Sujete las jeringas en las bombas de jeringa y conecte el tubo a las entradas de la mezcladora adecuadas. Coloque un pequeño vial de residuos debajo del tubo de salida para recoger el volumen de arranque. Prepare el baño y manténgalo cerca.
Simultáneamente, encienda las bombas y deje que unos cinco mililitros de efluentes fluyan en el vial de residuos. A continuación, comience a recoger las nanopartículas en el baño de enfriamiento como de costumbre. Si lo desea, se puede utilizar una placa de agitación para mezclar el baño de enfriamiento.
Cuatro réplicas de FNP de nanopartículas poliméricas con un núcleo hidrófobo, preparado en el mezclador CIJ, mostraron alta replicabilidad, y eran relativamente monodispersas, con un diámetro promedio de 107 nanómetros. Un error de disparo representativo por depresión lenta o desigual de la jeringa, produjo partículas ligeramente más grandes, mientras que la polidispersidad no se vio afectada en este ejemplo, los errores de encendido pueden dar lugar a distribuciones más polidispersas. La función de auto-correlación DLS se descomió suavemente para una muestra de nanopartícula polimérica representativa.
Esta descomposición suave no se observó cuando se intentó la formulación sin el estabilizador de copolímero de bloque, que produjo gotas de aceite a escala de micras en su lugar. La cantidad relativa de material central para estabilizar controlaba el tamaño de partícula, como se muestra aquí, en nanopartículas con un núcleo de poliestireno. La PDI estaba por debajo de 0,15 en cada formulación.
Nanopartículas con núcleos hidrófilos donde son producidas por IFNP. Las partículas con un núcleo de maltodextrina, preparadas en el mezclador CIJ, tenían unos 65 nanómetros de diámetro y tenían una PDI de 0,08. Las partículas con un núcleo de ovalbumina preparado en el micro MIVM tenían unos 125 nanómetros de diámetro, y tenían una PDI de 0,16.
FNP e IFNP son herramientas poderosas para procesar moléculas y nanopartículas. Antes de realizar cualquiera de las dos técnicas, asegúrese de tener en cuenta las solubilidades de cada componente en todos los disolventes, o mezclas de disolventes, para asegurar una alta super saturación durante la mezcla. La técnica básica es sencilla, pero dominar los pasos de depresión de la jeringa requiere cierta práctica.
Si tiene problemas con esto, considere el uso de una configuración de bomba de jeringa como la que se muestra en este video para mejorar la consistencia. Para moléculas hidrófilas cargadas, o moléculas con solubilidad intermedia, FNP puede combinarse con el emparejamiento de iones hidrófobos para permitir una encapsulación eficiente. FNP también se puede utilizar para encapsular múltiples compuestos en el mismo núcleo de nanopartículas.
Consulte el texto y otros recursos bibliográficos para aprender a eliminar mejor los disolventes orgánicos de las dispersiones de nanopartículas en la aplicación deseada. También hay una gama de técnicas para estabilizar nanopartículas durante el almacenamiento.
