Este trabajo fue financiado por los jugadores de golf contra el cáncer, Carolina del Centro para la Nanotecnología piloto beca para la excelencia, la Universidad de Cancer Research Fund y el Instituto Nacional de Salud K-12 Premio de Desarrollo Profesional.

1. Síntesis de PLGA-PEG-b polímero <ol><li> Poli (D, L-láctico-co-glicólico) (PLGA) con grupos terminales carboxilato (PLGA-carboxilato) se disuelve en los disolventes de PLGA (como se menciona en la sección de materiales) a una concentración de 5 mm. PLGA puede ser disuelto en esta concentración con agitación suave. </li><li> Ambos NHS (peso molecular 115,09) y el EDC (peso molecular 191,7) se disuelven en la solución de PLGA en una concentración de 25 mM. (Tanto la EDC y NHS se añaden en un exceso estequiométrico de 5 veces en comparación con PLGA). PLGA-carboxilato se convierte en PLGA-NHS mediante la adición de EDC y NHS de PLGA-carboxilato de solución con agitación suave durante 1 hora aproximadamente. </li><li> El producto de reacción PLGA-NHS se precipita por la adición de metanol de la solución de lavado. Aproximadamente 10 veces el exceso de volumen de metanol, se añade a la solución. La solución se centrifuga a 2000 xg para precipitar el PLGA-NHS y descartar el sobrenadante (elimina los rastros de la EDC y NHS. Este procedimiento de lavado con metanol se repite al menos tres veces. </li><li> El pellet de PLGA-NHS se seca al vacío durante 30 minutos para eliminar cualquier rastro de la solución de lavado. </li><li> El pellet de PLGA-NHS está re-disuelto en el mismo disolvente a la misma concentración que se utilizó inicialmente para disolver PLGA. El PEG heterobifuncionales (amino-PEG-carboxilato), se añade a la solución de PLGA en una concentración de 5 mm (relación estequiométrica de 1:1). La solución se incuba durante 24 horas con agitación constante. </li><li> Después de 24 horas, el producto de reacción PLGA-PEG-b de copolímero de bloque se precipita por la adición de la solución de lavado de metanol en exceso. Repita el proceso de lavado y centrifugación como se mencionó anteriormente en tres ocasiones. Esto eliminará todos los PEG exceso sin reaccionar. </li><li> El copolímero de PLGA-PEG-b bloques se seca al vacío. </li></ol> 2. PLGA-PEG-b preparación de nanopartículas Las nanopartículas con núcleo de PLGA cubiertos con PEG a la superficie se pueden preparar con estos copolímeros de bloque doble. Una variedad de diferentes fármacos hidrofóbicos pueden ser encapsulados en nanopartículas. Compuestos fluorescentes puede ser encapsulado en las nanopartículas, o puede ser conjugado con PLGA y por lo tanto estas nanopartículas se pueden utilizar para imágenes de fluorescencia. Nanoprecipitation método se utiliza para hacer las nanopartículas sobre todo cuando la carga que se desea encapsular es altamente hidrofóbico en la naturaleza. <ol><li> El PLGA-PEG-b de copolímero de bloque y de la droga / de carga (a encapsular) son disueltos en cualquier disolvente que disuelve PLGA. PLGA puede ser disuelto por muchos solventes comunes, como acetonitrilo, DCM, tetrahidrofurano, acetona o acetato de etilo. La elección del disolvente es crucial, ya que influye en las propiedades de las nanopartículas. Por lo tanto, disolvente apropiado se debe utilizar en este paso. </li><li> La mezcla de polímero / fármaco se añade gota a gota a 5.3 volúmenes de agua agitando dando una concentración de polímero final de alrededor de 3 mg / ml. (Fig. 2) </li><li> Se mantiene la agitación durante 2 horas a presión reducida para permitir que las nanopartículas se forman por el auto-ensamblaje y eliminar los restos de disolvente orgánico. </li><li> La recolección y purificación: Las nanopartículas son luego se concentró por centrifugación a 2.700 x g durante 10 minutos usando un filtro Amicon (MWCO 20 kDa), se lavan, y se reconstituyó en PBS. Esto elimina toda la carga sin atrapado drogas /. Caracterizaciones biofísicas básicas, tales como tamaño, carga superficial, y la eficiencia de carga de fármaco se puede realizar para comprender mejor las propiedades de las nanopartículas. </li></ol> 3. Almacenamiento La liofilización es un método comúnmente utilizado para almacenar las nanopartículas 11. La liofilización se conservan las características físicas y químicas de las nanopartículas para la estabilidad a largo plazo 12. El proceso de secado por congelación puede causar la tensión en las partículas y desestabilizar a la formulación, por lo que la crio-protectores (protección contra el estrés de congelación) y lyo-protectores (protección contra el estrés de secado) se utilizan comúnmente. La elección de estos protectores está determinado por el tiempo deseado de almacenamiento 13. <ol><li> En el secado por congelación, no es la solidificación total de la muestra mediante la congelación por debajo de su Tg. </li><li> En la etapa de secado, el hielo se elimina por sublimación. Temperatura y la presión debe ser optimizado para lograr un eficiente proceso de liofilización. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Caracterización de PLGA-PEG-b-Di copolímero de bloque Diferentes técnicas se pueden utilizar para confirmar la conjugación exitosa de los polímeros. La composición de PLGA-PEG-b se puede caracterizar con un 400 MHz 1H resonancia magnética nuclear (RMN). Peso molecular del producto formado (PLGA-PEG-b) puede ser verificada por cromatografía de permeación en gel (GPC). El PLGA-b - PEG de peso molecular distribution la curva y el tiempo de elución debe ser diferente de PLGA y solo PEG. En combinación, estas técnicas deben caracterizar el producto formado y determinar si la reacción de conjugación se ha realizado correctamente. Caracterización de PLGA-PEG-b nanopartículas El tamaño de partícula y distribución de tamaño puede ser medido por dispersión de luz dinámica. Diferentes parámetros en el proceso de nanoprecipitation afectar el tamaño de las partículas. Pesos moleculares de los polímeros utilizados inicialmente (tanto PLGA y PEG) también afectan la distribución del tamaño de las partículas. Microscopía de transición de electrones (TEM) también se puede utilizar para confirmar la distribución del tamaño y la estructura de las nanopartículas como se ve en la figura 3. El rango de tamaño de partícula es generalmente en el rango nm. De gran tamaño de partículas con distribución de tamaño irregular podría indicar un error en la reacción de conjugación o la optimización del método nanoprecipitation necesidades. Además, la superficie potencial zeta puede ser medido por ZetaPALS. La eficiencia de carga de fármaco / carga se puede cuantificar con el estándar de HPLC. Las partículas se disuelven en disolventes orgánicos y HPLC se pueden realizar para medir la absorción de la droga / carga (Fig. 4). El estudio de cinética de liberación de fármacos se puede hacer cuando se conozca cantidades fijas de las nanopartículas se dializan en 30 Slide-A-Lyzer unidades de diálisis MINI. En intervalos de tiempo fijos, el contenido de la unidad de diálisis se recoge y el mismo volumen de disolvente orgánico, se añade la disolución de las nanopartículas. HPLC se lleva a cabo en estas muestras para cuantificar el contenido de drogas / carga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" /> Figura 1. EDC / NHS química <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" /> Figura 2. Nanoprecipitation método para la preparación de nanopartículas poliméricas. La solución orgánica de un disolvente (acetonitrilo o DCM) que contiene el bloque doble PEG-PLGA y la droga o la carga que se carga en la partícula se añade gota a gota a 5.3 mL de agitación H 2 O. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" /> Figura 3. Microscopía Electrónica de Transmisión de nanopartices. Una imagen de TEM de PEG-PLGA nanopartículas que contienen wortamin. Ácido fosfotúngstico fue utilizado como un agente de contraste. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" /> Figura 4. Liberación controlada de drogas a partir de nanopartículas. Liberación de paclitaxel a partir de nanopartículas después de la diálisis en PBS. En el momento señalado, las partículas fueron retirados de cassettes de diálisis y solubilizados en acetonitrilo. La solución se midió por HPLC. Dos lotes separados de las nanopartículas fueron comparados. <div id="myEventWatcherDiv"></div><div id="myEventWatcherDiv"></div>

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	<li>Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Go&#235;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+polymers+in+pharmaceutical+and+biomedical+sciences.">Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).</li><li>Bulte, J. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).</li><li>Omid, C., Farokhzad, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Nanotechnology+on+Drug+Delivery.">Impact of Nanotechnology on Drug Delivery.</a> ACS NANO. 3, 16-20 (2009).</li><li>Li, Y. -. P., Pei, Y. -. Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+PLGA+nanoparticles+as+protein+carriers:+synthesis,+preparation+and+biodistribution+in+rats.">PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats.</a> Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate techniques. , (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+Functionalized+PLGA-PEG+Nanoparticles+for+In+Vivo+Targeted+Drug+Delivery.">Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery.</a> Biomaterials. 28, 869-876 (2007).</li><li>Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+engineering+of+targeted+nanoparticles+by+using+self-assembled+biointegrated+block+copolymers.">Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).</li><li>Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. 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Y., Kim, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectants+for+Freeze+Drying+of+Drug+Nano-Suspensions:+Effect+of+Freezing+Rate.">Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).</li><li>Wang, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+targeted+nanoparticles+for+therapeutic+applications.">Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications.</a> Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. 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No hay conflictos de interés declarado.

El método nanoprecipitation con copolímeros de bloque doble representa un método sencillo, rápido para diseñar nanopartículas poliméricas. Las nanopartículas resultantes se componen de un núcleo hidrofóbico que puede ser utilizado para la entrega de los compuestos de baja solubilidad. La capa de superficie hidrofílica permite una excelente solubilidad en el agua mientras que proporciona una fracción de la conjugación más potencial a un ligando de orientación. Hay muchas plataf...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> EDC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22980 </td><td> Conjugación del reactivo </td></tr><tr><td> NHS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 24500 </td><td> Conjugación del reactivo </td></tr><tr><td> amino-PEG-carboxilato </td><td> Laysan Bio Inc. </td><td> NH2-PEG-CM-5000 </td><td> Polímero (se puede usar cualquier MW PEG, 5000 está en la lista) </td></tr><tr><td> PLGA-carbxylate </td><td> Lactel </td><td> B6013-2 </td><td> Polímero </td></tr><tr><td> Diclorometano (DCM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34856 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Acetonitrilo&gt; 99% de pureza </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34851 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Metanol&gt; 99% de pureza </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34860 </td><td> Lavar </td></tr></tbody></table>

formulation of diblock polymeric nanoparticles through nanoprecipitation technique

La nanotecnología es una rama relativamente nueva de la ciencia que consiste en aprovechar las propiedades únicas de partículas que están en la escala de nanómetros (nanopartículas). Las nanopartículas pueden ser diseñados de una manera precisa en que la química puede ser su tamaño, la composición y la superficie cuidadosamente controladas. Esto permite una libertad sin precedentes para modificar algunas de las propiedades fundamentales de su carga, como la solubilidad, la difusividad, las características de liberación de biodistribución y la inmunogenicidad. Desde su creación, las nanopartículas se han utilizado en muchas áreas de la ciencia y la medicina, incluyendo la administración de fármacos, imágenes, y la biología celular 1-4. Sin embargo, no se ha utilizado plenamente fuera de &quot;laboratorios de nanotecnología&quot;, debido a la barrera percibida técnica. En este artículo se describe un método simple para sintetizar una plataforma basada en nanopartículas de polímeros que cuenta con una amplia gama de aplicaciones potenciales. El primer paso es sintetizar un copolímero de bloque doble que tiene tanto un dominio hidrofóbico y un dominio hidrofílico. Utilizando PLGA y PEG como polímeros modelo, que describe una reacción de conjugación con EDC / NHS química 5 (Fig. 1). También se discute el proceso de purificación del polímero. El bloque doble sintetizado co-polímero puede auto-ensamblan en las nanopartículas en el proceso de nanoprecipitation a través de interacciones hidrofóbicas hidrofílicos. Las nanopartículas de polímeros se describe es muy versátil. El núcleo hidrofóbico de las nanopartículas pueden ser utilizadas para llevar a los medicamentos poco solubles para la administración de fármacos experiments6. Además, las nanopartículas pueden superar el problema de solventes tóxicos para los reactivos de biología molecular poco solubles, tales como wortmannin, que requiere un solvente como el DMSO. Sin embargo, el DMSO puede ser tóxico para las células e interferir con el experimento. Estos fármacos poco solubles y los reactivos pueden ser efectivamente entregados el uso de nanopartículas de polímeros con una toxicidad mínima. Nanopartículas de polímeros también se pueden cargar con un colorante fluorescente y se utilizan para los estudios de tráfico intracelular. Por último, estas nanopartículas de polímeros se pueden conjugar a la orientación a través de ligandos PEG superficie. Tales nanopartículas dirigidas pueden ser utilizados para etiquetar epítopos específicos en las células o en 7.10.

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Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

En este artículo se describe un método para sintetizar nanoprecipitation a base de polímeros con nanopartículas de copolímeros de bloque doble. Vamos a discutir la síntesis de copolímeros de bloque doble, la técnica nanoprecipitation, y sus posibles aplicaciones.

Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

formulation-diblock-polymeric-nanoparticles-through-nanoprecipitation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

37.1K vistas.  University of North Carolina School of Medicine. En este artículo se describe un método para sintetizar nanoprecipitation a base de polímeros con nanopartículas de copolímeros de bloque doble. Vamos a discutir la síntesis de copolímeros de bloque doble, la técnica nanoprecipitation, y sus posibles aplicaciones.

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Investigación

Bioingeniería

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Células Madre Programación para Terapéutico Angiogénesis Uso Biodegradable polimérico nanopartículas

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabricación Microfluídica De Fibras Poliméricas Y Biohíbridas Con Tamaño y Forma Prediseñados

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fabrication polimérico matriz de microagujas por fotolitografía

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Fabricación superhidrófobas materiales poliméricos para aplicaciones biomédicas

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise regulation of gene activity. In particular, novel stimuli-responsive materials with improved spatiotemporal control over gene expression would unlock translatable platforms in drug discovery and regenerative medicine technologies. Furthermore, an enhanced ability to control nucleic acid release from materials would enable the development of streamlined methods to predict nanocarrier efficacy a priori, leading to expedited screening of delivery vehicles. Herein, we present a protocol for predicting gene silencing efficiencies and achieving spatiotemporal control over gene expression through a modular photo-responsive nanocarrier system. Small interfering RNA (siRNA) is complexed with mPEG-b-poly(5-(3-(amino)propoxy)-2-nitrobenzyl methacrylate) (mPEG-b-P(APNBMA)) polymers to form stable nanocarriers that can be controlled with light to facilitate tunable, on/off siRNA release. We outline two complementary assays employing fluorescence correlation spectroscopy and gel electrophoresis for the accurate quantification of siRNA release from solutions mimicking intracellular environments. Information gained from these assays was incorporated into a simple RNA interference (RNAi) kinetic model to predict the dynamic silencing responses to various photo-stimulus conditions. In turn, these optimized irradiation conditions allowed refinement of a new protocol for spatiotemporally controlling gene silencing. This method can generate cellular patterns in gene expression with cell-to-cell resolution and no detectable off-target effects. Taken together, our approach offers an easy-to-use method for predicting dynamic changes in gene expression and precisely controlling siRNA activity in space and time. This set of assays can be readily adapted to test a wide variety of other stimuli-responsive systems in order to address key challenges pertinent to a multitude of applications in biomedical research and medicine.

We present a novel method that uses photo-responsive block copolymers for more efficient spatiotemporal control of gene silencing with no detectable off-target effects. Additionally, changes in gene expression can be predicted using straightforward siRNA release assays and simple kinetic modeling.

Predicción de la silenciación génica a través del control espaciotemporal de la liberación de siRNA de Nanocarriers poliméricos fotosensibles

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Proteína quinasa c-Delta inhibidor péptido formulación usando nanopartículas de oro

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para la encapsulación de compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos en nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical success for treating previously &#8216;undruggable&#8217; hepatic disease targets with siRNA has been achieved. However, efficient tumor siRNA delivery necessitates additional pharmacokinetic design considerations, including long circulation time, evasion of clearance organs (e.g., liver and kidneys), and tumor penetration and retention. Here, we describe the preparation and in vitro physicochemical/biological characterization of polymeric nanoparticles designed for efficient siRNA delivery, particularly to non-hepatic tissues such as tumors. The siRNA nanoparticles are prepared by electrostatic complexation of siRNA and the diblock copolymer poly(ethylene glycol-b-[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-butyl methacrylate]) (PEG-DB) to form polyion complexes (polyplexes) where siRNA is sequestered within the polyplex core and PEG forms a hydrophilic, neutrally-charged corona. Moreover, the DB block becomes membrane-lytic as vesicles of the endolysosomal pathway acidify (&#60; pH 6.8), triggering endosomal escape and cytosolic delivery of siRNA. Methods to characterize the physicochemical characteristics of siRNA nanoparticles such as size, surface charge, particle morphology, and siRNA loading are described. Bioactivity of siRNA nanoparticles is measured using luciferase as a model gene in a rapid and high-throughput gene silencing assay. Designs which pass these initial tests (such as PEG-DB-based polyplexes) are considered appropriate for translation to preclinical animal studies assessing the delivery of siRNA to tumors or other sites of pathology.

Methods to prepare and characterize the physicochemical properties and bioactivity of neutrally-charged, pH-responsive siRNA nanoparticles are presented. Criteria for successful siRNA nanomedicines such as size, morphology, surface charge, siRNA loading, and gene silencing are discussed.

La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...