Este método puede ayudar a entender las preguntas clave en el campo de migración de células inmunitarias, como cómo el citoesqueleto envía fuerzas cortantes y cómo los ligandos de integrina y las quimioquinas afectan la migración inducida por el flujo de leucocitos. La principal ventaja de esta técnica es que es un nuevo tipo de ensayo de migración que es fácil de realizar para los principiantes. Utiliza sólo equipos y reactivos disponibles comercialmente, así como software libre.
Aunque este método puede proporcionar información sobre las células de la zona marginal B, también se puede aplicar a otras células inmunitarias, como las células T activadas. El día antes del experimento, descongelar una alícuota de ICAM-1, y diluirla en PBS a una concentración final de cinco microgramos por mililitro. A continuación, añada 30 microlitros de ICAM-1 a las cámaras deseadas de un portaobjetos de flujo.
Coloque el deslizamiento en una cámara húmeda y colóquelo en cuatro grados Celsius para incubar durante la noche. Al día siguiente, lave la cámara añadiendo 100 microlitros de PBS a un pozo y luego retirando 100 microlitros del otro pozo de la cámara. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo a una cámara e incubar el portaobjetos en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 90 minutos.
A continuación, lave la cámara añadiendo 100 microlitros de PBS a un pozo, retirándola del otro pozo, y luego agregue 100 microlitros de búfer de migración a la cámara. La diapositiva ya está lista para su uso. Guárdelo en una cámara húmeda a temperatura ambiente hasta el experimento.
En primer lugar, conecte una bomba de fluidos y conecte la unidad de fluidos. A continuación, encienda el software de la bomba. A continuación, lave el tubo una vez con cinco a 10 mililitros de búfer de migración.
Esto tomará alrededor de un minuto. A continuación, agregue 11,7 mililitros de búfer de migración por igual a ambos depósitos y elimine las burbujas de aire. Ahora, sujete el tubo a unos 10 centímetros de la pieza del conector y coloque la unidad fluida en la cámara de incubación calentada en el microscopio.
En el software, establezca la opción de diapositiva en micro-deslizamiento VI 0.4 y la opción de tubo en blanco. Además, establezca la tensión de cizallamiento deseada en alrededor de cuatro dynes por centímetro cuadrado y el tiempo de imagen a 30 minutos. A continuación, establezca el caudal deseado y la tensión de cizallamiento introduciendo los valores en el software de la bomba.
A continuación, precaliente la cámara de incubación del microscopio, la unidad de fluidos y las alícuotas del búfer de migración a 37 grados centígrados. Una vez caliente, pruebe la bomba fluida, asegurándose de que el búfer de migración fluya de ida y vuelta en los depósitos y de que no haya burbujas de aire en el sistema. En primer lugar, aislar los leucocitos y purificar las células marginales de la zona B como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña.
A continuación, limpie la parte inferior de la diapositiva con un tejido humedecido con etanol. Agregue 30 microlitros de la suspensión celular en un pozo de la cámara y retire 30 microlitros del búfer de migración almacenado del otro pozo. Cubra el portaobjetos e in incubarlo durante 30 minutos para permitir que las células se adhieran.
A continuación, agregue lentamente el búfer de migración precalentó a cada pozo de la diapositiva hasta que un menisco positivo salga del pozo. Retire las burbujas de aire con la punta de la pipeta. Es importante mantener la consistencia con los factores que afectan la adhesión de la célula, así que mantenga los búferes y las celdas en 37 grados, y evite el uso de fuerza excesiva al pipetear el búfer en la cámara.
Sujete la diapositiva a la etapa del microscopio y retire el lado sin marcar del tubo fluido de la pieza del conector. A continuación, llene el extremo de la tubería con búfer de migración hasta que un menisco positivo sin burbujas de aire se levante del final. Voltee el extremo del tubo e insértelo en el pozo superior de la cámara de flujo.
Mientras mantiene el tubo sujeta, repita el procedimiento para el extremo marcado de la tubería. Ahora, cambie el sistema de imágenes al modo Live y seleccione un campo de visión que esté en el centro de la diapositiva. Aquí, establece el foco en las celdas, y luego desenfoca ligeramente para mejorar el contorno negro de las células y producir un interior blanco.
El fondo negro y el centro blanco serán más fáciles de usar en el programa de seguimiento automatizado. Configure el programa de secuencia de imágenes para grabar una imagen cada cinco segundos durante 30 minutos utilizando un objetivo seco de 10 veces. A continuación, comience a grabar.
Retire la abrazadera del tubo y encienda la bomba. Esto hará que las células no adherentes se laven y las células adherentes comiencen a migrar. Al final del programa de imágenes, etiqueta y guarda la película.
Si utiliza un inhibidor o un modificador de migración celular, se puede agregar a las celdas de la suspensión celular antes de colocarlas en la diapositiva o al búfer de migración en la unidad de fluidos. Para comenzar el análisis automático de pistas de migración, abra el programa ImageJ. Copie el archivo Java MTrack2_kt en la carpeta ImageJ Plugins.
En el menú Plugins, seleccione Compilar y ejecutar. A continuación, reinicie ImageJ y el complemento debería aparecer en el menú Plugins. Abra la pila de imágenes de la película de migración de celdas en ImageJ y procese las imágenes como se muestra aquí para convertir el vídeo de marcos de color a imágenes de alto contraste que muestran las celdas como objetos negros sobre un fondo blanco.
A continuación, afilar las imágenes dos veces, despeckle las imágenes y, a continuación, convertir las imágenes a ocho bits. En el menú Imagen, vaya al submenú Ajustar brillo/contraste y coloque el control deslizante Contraste en el contraste máximo. Esto hará que las celdas aparezcan como objetos blancos sobre un fondo negro.
A continuación, vuelva al submenú Ajustar umbral para asegurarse de que las celdas aparecen como objetos negros sobre un fondo blanco. Ahora, ejecute el plugin de seguimiento automático de celdas MTrack2 kt. En la pantalla de opciones, establezca el tamaño de partícula mínimo en un píxel y el tamaño máximo de partícula en 30 píxeles.
Establezca el valor de velocidad en 10 píxeles, aunque las celdas de la zona marginal B generalmente no superarán los dos píxeles en fotogramas sucesivos que estén separados por cinco segundos. Las pistas celulares ya están listas para el análisis usando la herramienta ibidi Chemotaxis. Estos dos campos muestran las trayectorias de migración de las células marginales de la zona B que fueron sembradas en las diapositivas recubiertas ICAM-1.
Las celdas se realizaron un seguimiento automático con MTrack2 utilizando los métodos descritos en este artículo. A la izquierda, las células fueron escuchadas bajo condiciones estáticas, y en las celdas derechas se expusieron a un flujo de cizallamiento de cuatro dynes por centímetro cuadrado. Las pistas de celda individuales se pueden importar a la herramienta ibidi Chemotaxis para generar trazados de pista de cada película.
Aquí, las pistas de celda individuales se colorean de rojo para indicar que terminaron aguas abajo de su punto de origen o negro si terminaron aguas arriba. El análisis de pistas de celda de cuatro películas individuales para el flujo y ninguna condición de flujo se muestra aquí. Esto incluye el índice de migración direccional promedio, la velocidad de la celda, la rectitud de la ruta y la distancia final en línea recta para ambas condiciones.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo imaginar la migración direccional de las células marginales de la zona B hacia el flujo de cizallamiento y cómo rastrear automáticamente las células. Durante este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía TIRF para responder preguntas adicionales, como ¿cómo responden el citoesqueleto y las integrinas al estrés de cizallamiento?
