此方法可以帮助理解免疫细胞迁移领域中的关键问题，例如细胞骨架如何发送剪切力，以及整流体配体和化疗素如何影响白细胞的流动迁移。这种技术的主要优点是，它是一种新型的迁移检测，初学者很容易执行。它只使用市售设备和试剂以及自由软件。
虽然此方法可以提供对边缘区域 B 细胞的洞察，但它也可以应用于其他免疫细胞，如激活的 T 细胞。在实验前一天，解冻一个 ICAM-1 的等分，并在 PBS 中稀释至每毫升 5 微克的最终浓度。然后，将 30 微升 ICAM-1 添加到流滑梯所需的腔室。
将滑梯放入潮湿的室内，将其设定在摄氏四度，在一夜之间孵育。第二天，在一个井中加入100微升PBS，然后从井的另一个井中提取100微升，来清洗水室。然后，在腔室中加入100微升的阻尼缓冲液，并在室温下在潮湿室中孵化滑梯90分钟。
接下来，在一个井中加入100微升PBS，将其从另一个井中取走，然后向腔室添加100微升迁移缓冲液，清洗腔室。该幻灯片现在可以使用。在室温下将其存放在潮湿室，直到实验进行。
首先，插入流体泵，并连接流体单元。然后，打开泵软件。接下来，用5到10毫升的迁移缓冲液清洗一次管子。
这大约需要一分钟。然后，在两个储液罐中平均添加 11.7 毫升迁移缓冲液，并清除气泡。现在，将管子从连接器件夹住约 10 厘米，将流体单元放在加热孵化室的显微镜上。
在软件中，将幻灯片选择设置为微幻灯片 VI 0.4，将管选项设置为白色。此外，将所需的剪切应力设置为每平方厘米约 4 个 dynes，将成像时间设置为 30 分钟。然后，通过将值输入泵软件，设置所需的流速和剪切应力。
接下来，预热显微镜孵化室、流体单元和迁移缓冲液等值至37摄氏度。加热后，测试流体泵，确保迁移缓冲液在储液罐中来回流动，并且系统中没有气泡。首先，分离白细胞，并净化边缘区B细胞，如随附的文本协议所述。
然后，用乙醇抑制的组织清洁幻灯片底部。将30微升的细胞悬浮液加入腔室的一个井中，然后从另一个井中提取30微升存储的迁移缓冲液。盖住幻灯片，孵育30分钟，让细胞连接。
接下来，缓慢地将预热迁移缓冲区添加到幻灯片的每个井中，直到正半月板从井中升起。使用移液器尖端清除任何气泡。与影响细胞粘附的因素保持一致非常重要，因此将缓冲液和细胞保持 37 度，避免在将缓冲液移入腔室时使用过度的力。
将幻灯片夹到显微镜阶段，然后从连接器件上拆体管的未标记侧。然后，用迁移缓冲液填充油管的端，直到无气泡的正半月板从端出来。翻转油管的端，并将其插入流室的顶井。
在保持管子夹紧的同时，重复管的标记端的过程。现在，将成像系统切换到"实时"模式，然后选择幻灯片中间的视图字段。在这里，将焦点对等对细胞进行设置，然后稍微去聚焦，以增强细胞的黑色轮廓并产生白色内部。
黑色背景和白色中心将更容易在自动跟踪程序中使用。设置成像序列程序，使用 10 倍干燥目标，每 5 秒录制一张图像，30 分钟。然后，开始录制。
从油管上拆下夹子，然后打开泵。这将导致非粘附细胞洗掉，粘附细胞开始迁移。在成像程序结束时，标记并保存影片。
如果使用抑制剂或细胞迁移的修饰剂，可以在将细胞悬浮液放在幻灯片上之前将其添加到细胞悬浮液中的细胞或流体单元中的迁移缓冲液中。要开始自动迁移跟踪分析，请打开 ImageJ 程序。将MTrack2_kt文件复制到 ImageJ 插件文件夹。
在"插件"菜单下，选择"编译并运行"。然后，重新启动 ImageJ，插件应出现在插件菜单中。从 ImageJ 中的单元格迁移影片中打开图像堆栈，并处理此处显示的图像，以便将视频从彩色帧转换为高对比度图像，将单元格显示为白色背景上的黑色对象。
接下来，锐化图像两次，对图像进行脱皮，然后将图像转换为八位。在"图像"菜单中，转到"调整亮度/对比度"子菜单，然后将"对比度"滑块置于最大对比度。这会使单元格在黑色背景上显示为白色对象。
然后，返回"调整阈值"子对象，以确保单元格在白色背景上显示为黑色对象。现在，运行自动细胞跟踪插件MTrack2 kt。在选项屏幕上，将最小颗粒大小设置为 1 个像素，将粒子大小最大设置为 30 像素。
将速度值设置为 10 像素，尽管在相隔 5 秒的连续帧上，边缘区域 B 单元格通常不会超过两个像素。细胞轨道现在准备使用伊比迪化学工具进行分析。这两个字段显示了在 ICAM-1 涂层幻灯片上播种的边际区域 B 细胞的迁移路径。
使用本文中描述的方法使用 MTrack2 自动跟踪单元格。在左侧，细胞在静态条件下被成像，在右侧细胞暴露在每平方厘米四丁的剪切流中。单个单元格轨道可以导入到 ibidi Chemotaxis 工具中，以生成每个影片的轨道图。
在这里，单个单元格轨道为红色，表示它们在源点下游结束，如果结束为上游，则为黑色。此处显示了对四个单独影片的单元格轨迹的分析，这些影片的流量和没有流条件。这包括两个条件的平均方向迁移指数、单元速度、路径直线度和最终直线距离。
观看此视频后，您应该清楚地了解如何对边缘区域 B 细胞向剪切流的方向迁移以及如何自动跟踪细胞进行成像。在此过程期间，可以执行其他方法（如 TIRF 显微镜）来回答其他问题，例如细胞骨架和集成素如何响应剪切应力？
