この方法は、細胞骨格がせん断力を送る方法や、インテグリンリガンドとケモカインが白血球のフロー誘発性移動にどのような影響を与えるかなど、免疫細胞移行分野の重要な質問を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、初心者が実行しやすい新しいタイプの移行アッセイです。市販の機器や試薬、フリーソフトウェアのみを使用しています。
この方法は、周辺ゾーンB細胞に関する洞察を提供することができるが、活性化されたT細胞などの他の免疫細胞にも適用することができる。実験の前日に、ICAM-1のアリコートを解凍し、PBSで1ミリリットル当たり5マイクログラムの最終濃度に希釈する。次に、フロースライドの所望のチャンバーにICAM-1の30マイクロリットルを加えます。
スライドを湿気の多いチャンバーに入れ、摂氏4度に設定して一晩インキュベートします。翌日、1ウェルに100マイクロリットルのPBSを加えてチャンバーを洗浄し、チャンバーの他のウェルから100マイクロリットルを引き出します。次いで、100マイクロリットルのブロッキングバッファーをチャンバーに加え、室温で湿度の高いチャンバーにスライドを90分間インキュベートする。
次に、1つの井戸に100マイクロリットルのPBSを加えてチャンバーを洗浄し、もう一方の井戸から引き出し、100マイクロリットルの移動バッファーをチャンバーに加えます。スライドを使用する準備ができました。実験まで室温で湿気の多いチャンバーに保管してください。
まず、流体ポンプを差し込み、流体ユニットを取り付けます。次に、ポンプソフトウェアをオンにします。次に、5~10ミリリットルの移行バッファーでチューブを1回洗います。
これには約1分かかります。次に、両方の貯留槽に11.7ミリリットルの移動バッファーを均等に加え、気泡を取り除きます。さて、コネクタ片からチューブを約10センチメートルクランプし、加熱されたインキュベーションチャンバーに流体ユニットを顕微鏡に置きます。
ソフトウェアでは、スライドの選択をマイクロスライドVI 0.4に、チューブオプションを白に設定します。また、所望のせん断応力を1平方センチメートルあたり約4ダイン、イメージング時間を30分に設定します。次に、ポンプソフトウェアに値を入力して、所望の流量とせん断応力を設定します。
次に、顕微鏡インキュベーションチャンバー、流体ユニット、および移動バッファーアリコートを摂氏37度に予め温める。ウォームが加わったら、流体ポンプをテストし、移動バッファが貯水池を行ったり来たりして、システムに気泡がないことを確認します。まず、白血球を単離し、付随するテキストプロトコルに記載されているように、限界領域B細胞を浄化する。
次に、エタノールを湿らせた組織でスライドの底部を洗浄します。30マイクロリットルのセル懸濁液をチャンバの1つのウェルに加え、貯めた移動バッファーの30マイクロリットルを他方の井戸から引き出す。スライドを覆い、30分間インキュベートして細胞を取り付けます。
次に、正の半月板が井戸から上がるまで、スライドの各ウェルに温め込まれた移行バッファをゆっくりと追加します。ピペットチップで気泡を取り除きます。細胞接着に影響を与える因子との一貫性を保つことが重要ですので、バッファーと細胞を37度に保ち、バッファーをチャンバにピペットする際には過度の力を使わないようにしてください。
スライドを顕微鏡ステージにクランプし、滑らかなチューブの無印の側面をコネクタから取り外します。その後、気泡のない正の半月板が終わりから上がるまで、チューブの端を移動バッファで満たします。チューブの端を裏返し、フローチャンバーの上部ウェルに挿入します。
チューブをクランプしたまま、チューブのマークされた端に対して手順を繰り返します。次に、イメージングシステムをライブモードに切り替え、スライドの中央にある視野を選択します。ここでは、細胞に焦点を当て、その後、細胞の黒い輪郭を強化し、白い内部を生成するためにわずかに焦点を外します。
黒の背景と白の中央は、自動追跡プログラムで使いやすくなります。10xドライ目的を使用して、5秒ごとに1つの画像を30分間記録するようにイメージングシーケンスプログラムを設定します。次に、録音を開始します。
チューブからクランプを取り外し、ポンプをオンにします。これにより、非接着性細胞が洗い流され、接着細胞が移行を開始します。イメージングプログラムの最後に、ムービーにラベルを付けて保存します。
細胞遊動の阻害剤または修飾剤を使用する場合、スライドに置く前に細胞懸濁液中の細胞または流体ユニットのマイグレーションバッファに追加することができる。自動移行トラック分析を開始するには、ImageJ プログラムを開きます。MTrack2_ktの Java ファイルを ImageJ プラグイン フォルダーにコピーします。
[プラグイン] メニューの [コンパイルして実行] を選択します。次に、ImageJ を再起動すると、プラグインがプラグインメニューに表示されます。ImageJ でセルマイグレーションムービーからイメージスタックを開き、画像をカラーフレームから白い背景上の黒いオブジェクトとして表示するハイコントラスト画像に変換するために、ここに示すようにイメージを処理します。
次に、画像を 2 回シャープにし、イメージをデスペクするイメージを 8 ビットに変換します。[イメージ] メニューの [明るさ/コントラストの調整] サブメニューに移動し、[コントラスト] スライダを最大コントラストにします。これにより、黒い背景に白いオブジェクトとして表示されます。
次に、[閾値の調整] サブメニューに戻り、白い背景に黒のオブジェクトとして表示されるようにします。次に、自動セル追跡プラグイン MTrack2 kt を実行します。オプション画面で、パーティクルサイズの最小値を 1 ピクセルに、最大 30 ピクセルに設定します。
速度値を 10 ピクセルに設定しますが、周辺ゾーン B セルは通常、5 秒間隔の連続したフレームでは 2 ピクセルを超えないでしょう。セルトラックは、ibidi Chemotaxis ツールを使用して解析できるようになりました。これら 2 つのフィールドは、ICAM-1 コーティング スライドにシードされた限界ゾーン B 細胞の移動経路を示します。
この資料で説明した方法を使用して、セルを MTrack2 で自動的に追跡しました。左側では、細胞を静的な条件下で画像化し、右側の細胞に4つのダイン/平方センチメートルのせん断流を浴びせた。個々のセルトラックを ibidi Chemotaxis ツールに読み込み、各ムービーのトラックプロットを生成することができます。
ここでは、個々のセルトラックが赤で色付けされ、原点の下流で終了したことを示し、上流に終わった場合は黒色になります。フロー条件とフロー条件の両方について、4つの個別のムービーのセルトラックの解析を次に示します。これには、両方の条件の平均方向移動インデックス、セル速度、パスの直線性、および最終直線距離が含まれます。
このビデオを見た後、シアーフローに向かって限界ゾーンB細胞の方向移動をイメージする方法と、セルを自動的に追跡する方法を理解する必要があります。この手順の間に、TIRF顕微鏡のような他の方法は、細胞骨格およびインテグリンがせん断応力にどのように反応するかのような追加の質問に答えるために行うことができるか。
