이 방법은 세포골격이 전단 력을 보내는 방법과 인테그린 리간드 및 케모카인이 백혈구의 흐름 유도 이동에 미치는 영향과 같은 면역 세포 이동 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초보자가 쉽게 수행할 수 있는 새로운 유형의 마이그레이션 분석이라는 것입니다. 그것은 단지 시판 될 수있는 장비와 시약뿐만 아니라 무료 소프트웨어를 사용합니다.
이 방법은 한계 영역 B 세포에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 활성화 된 T 세포와 같은 다른 면역 세포에도 적용 될 수 있습니다. 실험 전날, ICAM-1의 알리쿼트를 해동하고 PBS에서 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도로 희석한다. 그런 다음, 플로우 슬라이드의 원하는 챔버에 ICAM-1의 30 마이크로 리터를 추가합니다.
슬라이드를 습한 챔버에 넣고 섭씨 4도에 설정하여 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 100 개의 PBS 마이크로 리터를 하나의 우물에 추가 한 다음 챔버의 다른 우물에서 100 마이크로 리터를 철회하여 챔버를 세척하십시오. 그런 다음, 챔버에 블로킹 버퍼 100 마이크로리터를 추가하고, 90 분 동안 실온에서 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다.
다음으로, PBS의 100 마이크로리터를 하나의 우물에 추가하여 챔버를 씻고, 다른 우물에서 철수한 다음, 챔버에 100 마이크로리터의 마이그레이션 버퍼를 추가합니다. 이제 슬라이드를 사용할 준비가 되었습니다. 실험전까지 실온에서 습한 챔버에 보관하십시오.
먼저 유체 펌프를 연결하고 유체 장치를 부착합니다. 그런 다음 펌프 소프트웨어를 켭니다. 다음으로, 마이그레이션 버퍼의 5~10 밀리리터로 튜브를 한 번 씻으시다.
이 약 1 분 정도 걸릴 것입니다. 그런 다음 11.7 밀리리터의 마이그레이션 버퍼를 두 저장소에 동등하게 추가하고 기포를 제거합니다. 지금, 커넥터 조각에서 약 10 센티미터 튜브를 고정하고 현미경에 가열 된 인큐베이션 챔버에 유체 단위를 배치합니다.
소프트웨어에서 슬라이드 선택을 마이크로 슬라이드 VI 0.4로 설정하고 튜빙 옵션을 흰색으로 설정합니다. 또한 원하는 전단 응력은 평방 센티미터 당 약 4 개의 dyne과 이미징 시간을 30 분으로 설정합니다. 그런 다음 펌프 소프트웨어에 값을 입력하여 원하는 유량 및 전단 응력설정합니다.
다음으로, 현미경 잠복실, 유체 장치 및 이주 버퍼 알리쿼트를 섭씨 37도로 미리 데우도록 합니다. 따뜻해지면 유체 펌프를 테스트하여 마이그레이션 버퍼가 저장소에서 앞뒤로 흐르고 시스템에 기포가 없도록 합니다. 먼저, 백혈구를 분리하고, 동반텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이 한계 영역 B 세포를 정화한다.
그런 다음 슬라이드 바닥을 에탄올 약정 조직으로 청소합니다. 30 마이크로리터의 셀 서스펜션을 챔버의 한 우물에 넣고, 저장된 마이그레이션 버퍼의 마이크로리터 30개를 다른 우물에서 철수시다. 슬라이드를 덮고 30분 동안 배양하여 세포가 부착되도록 합니다.
그런 다음 긍정적인 반월상연경이 우물에서 나올 때까지 슬라이드의 각 웰에 미리 따뜻해지는 마이그레이션 버퍼를 천천히 추가합니다. 파이펫 팁으로 기포를 제거합니다. 세포 접착력에 영향을 미치는 인자와 일관성을 유지하는 것이 중요하므로 버퍼와 셀을 37도 유지하며 버퍼를 챔버로 파이프할 때 과도한 힘을 사용하지 않도록 하십시오.
슬라이드를 현미경 단계로 고정하고 커넥터 조각에서 유체 튜브의 표시되지 않은 측면을 제거합니다. 그런 다음 기포가없는 긍정적 인 반월 상연이 끝날 때까지 마이그레이션 버퍼로 튜브의 끝을 채웁니다. 튜브 의 끝을 뒤집어 서체 챔버의 상단 우물에 삽입합니다.
튜브를 고정하는 동안 튜브의 표시된 끝에 대한 절차를 반복하십시오. 이제 이미징 시스템을 라이브 모드로 전환하고 슬라이드 중간에 있는 시야를 선택합니다. 여기서, 세포에 초점을 설정한 다음 세포의 검은 윤곽을 향상시키고 흰색 내부를 생성하기 위해 약간 초점을 제거합니다.
검은색 배경과 흰색 센터는 자동 추적 프로그램에서 사용하기 쉽습니다. 10배 건조 목표를 사용하여 5초마다 하나의 이미지를 30분마다 기록하는 이미징 서열 프로그램을 설정합니다. 그런 다음 녹음을 시작합니다.
튜브에서 클램프를 제거하고 펌프를 켭니다. 이렇게 하면 비 부착 된 세포가 씻겨 내고 부착 된 세포가 마이그레이션되기 시작합니다. 이미징 프로그램의 끝에서, 라벨과 영화를 저장합니다.
셀 마이그레이션의 억제제 또는 수정자를 사용하는 경우, 슬라이드 또는 유체 학적 단위의 마이그레이션 버퍼에 넣기 전에 세포 현탁액의 세포에 추가 될 수 있습니다. 자동 마이그레이션 트랙 분석을 시작하려면 ImageJ 프로그램을 엽니다. MTrack2_kt Java 파일을 ImageJ 플러그인 폴더에 복사합니다.
플러그인 메뉴에서 컴파일 및 실행을 선택합니다. 그런 다음 ImageJ를 다시 시작하고 플러그인이 플러그인 메뉴에 나타납니다. ImageJ의 셀 마이그레이션 동영상에서 이미지 스택을 열고 여기에 표시된 대로 이미지를 처리하여 비디오를 컬러 프레임에서 흰색 배경의 검은 색 개체로 셀을 보여주는 고대비 이미지로 변환합니다.
다음으로 이미지를 두 번 선명하게 하고 이미지를 비적한 다음 이미지를 8비트로 변환합니다. 이미지 메뉴에서 밝기/대비 조정 하위 메뉴로 이동하여 대비 슬라이더를 최대 대비로 설정합니다. 이렇게 하면 셀이 검은색 배경에 흰색 개체로 표시됩니다.
그런 다음 임계값 조정 하위 메뉴로 돌아가서 셀이 흰색 배경에 검은 개체로 표시되도록 합니다. 지금, 자동 셀 추적 플러그인 MTrack2 kt를 실행합니다. 옵션 화면에서 파티클 크기를 최소 한 픽셀로 설정하고 파티클 크기를 최대 30픽셀로 설정합니다.
속도 값을 10픽셀로 설정하지만 한계 영역 B 셀은 일반적으로 5초 간격으로 연속 프레임에서 2픽셀을 초과하지 않습니다. 셀 트랙은 이제 ibidi Chemotaxis 도구를 사용하여 분석을 위한 준비가 되었습니다. 이 두 필드는 ICAM-1 코팅 슬라이드에서 시드된 한계 영역 B 셀의 마이그레이션 경로를 보여 줍니다.
이 문서에서 설명한 메서드를 사용하여 셀을 MTrack2로 자동으로 추적했습니다. 왼쪽에서, 세포는 정적 조건하에서 심화되었고, 오른쪽 세포는 평방 센티미터 당 4 개의 왕조의 전단 흐름에 노출되었다. 개별 셀 트랙은 각 영화의 트랙 플롯을 생성하기 위해 ibidi Chemotaxis 도구로 가져올 수 있습니다.
여기서 개별 셀 트랙은 빨간색으로 표시되어 원점의 하류또는 상류로 끝나면 검은색으로 종료되었음을 나타냅니다. 흐름과 유동 조건 모두에 대한 네 개의 개별 영화에서 셀 트랙의 분석은 여기에 표시됩니다. 여기에는 두 조건에 대한 평균 방향 이동 지수, 세포 속도, 경로 직선 및 최종 직선 거리가 포함됩니다.
이 비디오를 시청한 후, 전단 흐름을 향해 한계 영역 B 셀의 방향 이동을 이미지하는 방법과 자동으로 셀을 추적하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 이 절차 도중, TIRF 현미경 검사법과 같은 그밖 방법은 세포골격 및 통합이 전단 응력에 어떻게 반응합니까와 같은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다?
