Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre sobre el papel de las células madre adultas en la regulación del comportamiento de las células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación de las interacciones de células cancerosas y células madre in vitro sin el uso de organismos vivos. Esta técnica tiene potencial para la metástasis del cáncer, ya que modela el papel promotor de las células madre adultas en la metástasis del cáncer a los tejidos duros como el hueso.
La demostración del procedimiento será llevada a cabo por Huseyin Apdik, un postdoctoral en mi laboratorio. Comience por usar fórceps de extracción estériles para extraer el tejido pulpar del centro de las muelas del juicio obtenidas de adultos jóvenes de 17 a 20 años de edad. Coloque el tejido en DMEM completo en frío en platos de cultivo de tejido de 10 centímetros y use un bisturí para picar las muestras en fragmentos de dos a tres milímetros.
Transfiera las piezas de cada plato a pozos individuales de un cultivo de tejidos tratados con placa de seis pozos y cubra los tejidos en cada pozo con 200 microlitros de DMEM completo. Permita que los tejidos se adhieran a los fondos de los pozos con una incubación de al menos dos horas en una incubadora de cultivo celular humidificado de 37 grados Celsius y 5%CO2. Al final de la incubación, alimentar los tejidos con dos a 2,5 mililitros de medio fresco completo y cultivar las células durante ocho a nueve días adicionales.
Cuando el cultivo haya alcanzado el 80% de confluencia, lave cada pozo con dos mililitros de PBS seguidos de desprendimiento de las células con dos mililitros de trippsina a 37 grados centígrados. Después de dos minutos, detenga la reacción con dos mililitros de DMEM completo por pozo y recoja las células por centrifugación. Luego, resuspender los pellets en 15 mililitros de medio fresco completo por dos pozos de células y pasar las células a los matraces T75 para su cultivo posterior.
Después de al menos ocho pasajes, visualice las células por microscopía de luz. Las células madre de pulpa dental deben haberse unido a los platos de cultivo y deben mostrar una morfología celular similar a un husillo. Para el análisis de marcadores de superficie, después de demostrar la tripsinación, fije las células con 4%paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente en tubos de 1,5 mililitros seguidos de tres lavados en 500 microlitros de PBS por lavado.
Después del último lavado, etiquete las células con los anticuerpos de interés adecuados en 100 microlitros de PBS por tubo durante una hora a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave las células tres veces en PBS como se ha demostrado y etiquete las células con los anticuerpos secundarios apropiados en 100 microlitros de PBS por tubo durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lave las muestras tres veces en PBS y analice las células por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar.
Para la diferenciación de las células madre de la pulpa dental, se siembra una vez 10 a las cuatro células en pozos individuales de placas de 24 pocillos en 500 microlitros de DMEM completo para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, reemplace el medio en cada pozo con el medio de diferenciación adecuado y devuelva las células a la incubadora, refrescando el medio dos veces por semana durante dos semanas. La diferenciación puede ser confirmada por la tinción azul de von Kossa y Alcian de acuerdo con los protocolos estándar.
Después de dos a cuatro pasajes, recoger los sobrenadantes medios acondicionados de las células madre de pulpa dental cultivadas cuando los cultivos alcanzan el 80% de confluencia. Luego, centrifuga el medio recolectado para eliminar cualquier material de tejido de desecho y desechos celulares y almacenar el medio en 20 grados Celsius negativos hasta su uso. Para el tratamiento de células cancerosas, se siembra una vez 10 a las cinco células tumorales en pozos individuales de una placa de 12 pocillos para la incubación durante la noche a 37 grados celsius y 5%CO2.
A la mañana siguiente, utilice una punta estéril de 200 microlitros para hacer una lesión por arañazos en cada pozo y reemplace inmediatamente el sobrenadante en cada pozo con un medio fresco que contenga varias concentraciones de medio acondicionado. A continuación, observe inmediatamente los arañazos bajo un microscopio invertido y obtenga imágenes de los cultivos lesionados a intervalos de tiempo regulares. Al final del análisis, mida el cierre de arañazos con el tiempo en ImageJ.
Para evaluar la migración de células madre de pulpa dental, primero se siembra tres veces 10 a las cuatro células madre de pulpa dental en insertos individuales de placas de 24 pozos con poros de 0,4 micras en 250 microlitros de DMEM e incubar las plaquitas durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, sembra cinco veces 10 las cuatro células tumorales en pozos individuales de una placa de 24 pocillos en 500 microlitros de DMEM para la incubación durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, rasca las células tumorales como se demuestra.
Sustituya los sobrenadantes por 500 microlitros de DMEM fresco y coloque un inserto de semilla de células madre de pulpa dental en cada bien alimentado con medio fresco. Luego observe inmediatamente las células en un microscopio invertido e imagine las células a intervalos regulares para evaluar la migración de células madre de pulpa dental. Para evaluar las interacciones directas de las células madre de pulpa dental con células cancerosas, pruebe cada cultivo etiquetado para obtener suspensiones de una sola célula y recoger las células disociadas por centrifugación.
Resuspender los pellets en diferentes soluciones de tinte del vinculador celular preparadas en tampón C diluyente, suministradas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e incubar las células son temperatura ambiente durante 10 minutos. Terminar la reacción de tinción con 100 microlitros de suero bovino fetal y recoger las células por centrifugación. A continuación, centrifugar las células con medio de crecimiento completo antes de encollar cinco veces 10 a las cuatro células madre de pulpa dental y células tumorales por pozo en una placa de seis pozos en una proporción de uno a uno en dos mililitros de medio completo.
Recoger las células después de 24 o 48 horas de incubación por centrifugación seguida de un lavado en PBS. Luego, resuspendir las células en 300 microlitros de búfer de clasificación de células activado por fluorescencia en tubos de citometría de flujo redondo de cinco mililitros y vórtice para dispersar cualquier agregado celular antes de analizar las células de acuerdo con los protocolos de análisis citométrico de flujo estándar. Las células madre de pulpa dental exhiben una morfología celular similar a un fibroblastos después del enchapado y expresan antígenos de superficie de células madre mesenquimales, pero no marcadores de células hematopoyéticas.
También se observan cambios a nivel morfológico y molecular relacionados con la diferenciación osteo, condro y adipogénica en los cultivos de células madre de pulpa dental después de la aplicación adecuada del cóctel de diferenciación. El tratamiento de cultivos celulares tumorales lesionados con 10 y 20% de concentraciones de medio condicionado aumenta significativamente el cierre de arañazos en comparación con los cultivos celulares tumorales de control medio. Las moléculas secretadas de células madre de pulpa dental insertan co-cultivos también aumentaron el cierre de arañazos en las células tumorales lesionadas en comparación con los co-cultivos celulares de control.
El análisis del microscopio de fluorescencia de las interacciones del tallo de la pulpa dental y las células tumorales dentro de un cultivo celular in vitro revela la creación de una estructura bien organizada dentro de la cual las células tumorales proliferan rápidamente después de 48 horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener dos muestras de tejido en medio frío y transportar inmediatamente muestras al laboratorio para minimizar la muerte celular. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en los campos de células madre en la exploración de interacciones de cáncer de células madre adultas en seres humanos.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el rastreo de células inmunitarias para células etiquetadas diferenciales de varios tipos de células madre y cáncer para responder preguntas adicionales sobre cómo las células madre adultas interactúan con las células cancerosas y controlan la metástasis del cáncer. No olvide que trabajar con las muestras humanas puede ser peligroso y que las precauciones tales como analizar muestras de pacientes para enfermedades infecciosas y obtener el consentimiento escrito del paciente siempre deben implementarse al realizar este procedimiento.
