שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע על תפקידם של תאי גזע בוגרים בוויסות התנהגות תאים סרטניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה של אינטראקציות תאים סרטניים ותאי גזע במבחנה ללא שימוש באורגניזמים חיים. טכניקה זו יש פוטנציאל גרורות סרטן כפי שהוא מודלים את התפקיד המקדם של תאי גזע בוגרים גרורות סרטן לרקמות קשות כגון עצם.
הדגמה של ההליך תבוצע על ידי חוסיין אפיק, פוסט-דוקטורט במעבדה שלי. התחל באמצעות מדפים מיצוי סטרילי כדי להסיר את רקמת עיסת ממרכז שיני בינה המתקבלים מבוגרים צעירים בגילאי 17 עד 20 שנים. מניחים את הרקמה ב- DMEM שלם קר במנות תרבות רקמה של 10 ס"מ ולהשתמש באזמל כדי לטחון את הדגימות לרסיסים של שניים עד שלושה מילימטרים.
מעבירים את החלקים מכל מנה לתוך בארות בודדות של תרבות רקמות שטופלו צלחת שש בארות לכסות את הרקמות בכל באר עם 200 microliters של DMEM מלא. אפשרו לרקמות להיצמד לתחתית הבאר עם דגירה של שעתיים לפחות באינקובטור לח, 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. בסוף הדגירה, להאכיל את הרקמות עם שניים עד 2.5 מיליליטר של מדיום שלם טרי ותרבות התאים במשך שמונה עד תשעה ימים נוספים.
כאשר התרבות הגיעה 80%confluency, לשטוף כל טוב עם שני מיליליטר של PBS ואחריו ניתוק של התאים עם שני מיליליטר של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות, לעצור את התגובה עם שני מיליליטר של DMEM מלא לגם ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר כדורי ב 15 מיליליטר של מדיום שלם טרי לכל שתי בארות של תאים ולהפוך את התאים לתוך flasks T75 לתרבות הבאה שלהם.
לאחר שמונה קטעים לפחות, לדמיין את התאים על ידי מיקרוסקופ אור. תאי גזע עיסת שיניים צריך להיות מחובר מנות התרבות צריך להציג מורפולוגיה תא דמוי ציר. לניתוח סמן פני השטח, לאחר הוכחת טריפסיניזציה, תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בצינורות 1.5 מיליליטר ואחריו שלוש שטיפות ב 500 microliters של PBS לכל לשטוף.
לאחר הכביסה האחרונה, סמן את התאים עם הנוגדנים המתאימים של עניין 100 microliters של PBS לצינור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים PBS כפי שהודגם ולתייג את התאים עם נוגדנים משניים המתאימים 100 microliters של PBS לצינור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBS ולנתח את התאים על ידי ציטומטריה זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
עבור ההידול של תאי גזע עיסת שיניים, זרע פעם אחת 10 לארבעת התאים לתוך בארות בודדות של 24 בארות צלחות ב 500 microliters של DMEM מלא עבור דגירה 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא. למחרת, להחליף את המדיום בכל באר עם מדיום ההידול המתאים ולהחזיר את התאים לאנקובטור, לרענן את המדיום פעמיים בשבוע במשך שבועיים. בידול יכול להיות מאושר על ידי פון קוסה וכתמים כחולים אלסיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
לאחר שניים עד ארבעה קטעים, לאסוף את supernatants בינוני מותנה מן תאי גזע עיסת שיניים מתורבתים כאשר התרבויות להגיע 80% confluency. לאחר מכן, צנטריפוגה המדיום שנאסף כדי להסיר כל חומר רקמת פסולת ופסולת תא ולאחסן את המדיום ב 20 מעלות צלזיוס שלילי עד השימוש. לטיפול בתאי סרטן, זרע אחד פעמים 10 לחמשת תאי הגידול לתוך בארות בודדות של צלחת 12 באר עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%CO2.
למחרת בבוקר, השתמשו בקצה סטרילי של 200 מיקרוליטר כדי לגרום לפגיעה בשריטה בכל באר ולהחליף מיד את העל-טבעי בכל באר במדיום טרי המכיל ריכוזים שונים של מדיום מותנה. לאחר מכן, מיד להתבונן שריטות תחת מיקרוסקופ הפוך ולקבל תמונות של תרבויות פצועים במרווחי זמן קבועים. בסוף הניתוח, למדוד את סגירת השריטה לאורך זמן ב ImageJ.
כדי להעריך את נדידת תאי גזע עיסת שיניים, הזרע הראשון שלוש פעמים 10 לארבעה תאי גזע עיסת שיניים על צלחת בודדת 24 באר מכניס עם 0.4 נקבוביות מיקרון ב 250 microliters של DMEM ו דגירה מוסיף לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, זרע חמש פעמים 10 ארבעת תאי הגידול לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר ב 500 microliters של DMEM עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לגרד את התאים הגידוליים כפי שהודגם.
החלף את supernatants עם 500 microliters של DMEM טרי וממקמים תא גזע עיסת שיניים אחד זרעים להוסיף לתוך כל מוזנים היטב עם מדיום טרי. ואז מיד להתבונן בתאים על מיקרוסקופ הפוך ותמונה התאים במרווחי זמן קבועים כדי להעריך נדידת תאי גזע עיסת שיניים. כדי להעריך את האינטראקציות הישירות של תאי גזע עיסת שיניים עם תאים סרטניים, trypsinize כל תרבות שכותרתו כדי להשיג השעיות תא יחיד ולאסוף את התאים ניתוק על ידי צנטריפוגה.
תן את הכדורים בפתרונות צבע מקשר תאים שונים שהוכנו במאגר C diluent, המסופקים על פי הוראות היצרן, ודגירה התאים הם טמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לסיים את תגובת הכתמים עם 100 microliters של סרום חזיר עוברי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ואז צנטריפוגה התאים עם מדיום צמיחה מלא לפני ציפוי חמש פעמים 10 לארבעה תאי גזע עיסת שיניים ותאי גידול ל הבאר בצלחת שש באר ביחס של אחד לאחד בשני מיליליטר של מדיום שלם.
לאסוף את התאים לאחר 24 או 48 שעות של דגירה על ידי צנטריפוגה ואחריו לשטוף PBS. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאים ב- 300 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות בצינורות ציטומטריה של זרימה עגולה-תחתונה של חמישה מיליליטר ומערבולת כדי לפזר צבירות תאים לפני ניתוח התאים על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים. תאי גזע עיסת שיניים להפגין מורפולוגיה תא דמוי פיברובלסט לאחר ציפוי ולהביע אנטיגנים משטח תאי גזע mesenchymal אבל לא סמני תא hematopoietic.
שינויים ברמה המורפולוגית והמולקולרית הקשורים אוסטאו, כונדרו, ובידול adipogenic נצפו גם בתרבויות תאי גזע עיסת שיניים בעקבות יישום קוקטייל הבידול המתאים. הטיפול בתרבויות תאים סרטניים שנפגעו מאפס עם ריכוזים של 10 ו -20% של מדיום ממוזג מגביר את סגירת השריטה באופן משמעותי בהשוואה לתרבויות תאי הגידול שטופלו בבקרה-בינונית. מולקולות מופרשות מתאי גזע עיסת שיניים להוסיף תרבויות שיתוף גם גדל סגירת שריטה בתאי גידול פצועים בהשוואה לתאי בקרה שיתוף תרבויות.
ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של האינטראקציות של גזע עיסת שיניים ותא גידול בתוך תרבות תאי במבחנה חושף את היצירה של מבנה מאורגן היטב שבו תאים סרטניים מתרבים במהירות לאחר 48 שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על שתי דגימות רקמה במדיום קר מיד להעביר דגימות למעבדה כדי למזער את המוות של התא. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בשדות תאי הגזע בחקירת אינטראקציות סרטן תאי גזע בוגרים בבני אדם.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מעקב אחר תאים חיסוניים עבור תאים דיפרנציאליים המסומן בתאי גזע וסרטן שונים כדי לענות על שאלה נוספת לגבי האופן שבו תאי גזע בוגרים מתקשרים עם תאים סרטניים ושולטים גרורות בסרטן. אל תשכח כי עבודה עם הדגימות האנושיות יכול להיות מסוכן, כי אמצעי זהירות כגון ניתוח דגימות החולה למחלות זיהומיות וקבלת הסכמת המטופל בכתב תמיד צריך להיות מיושם בעת ביצוע הליך זה.
