Esta técnica aprovecha la microscopía de escaneo láser multifotón junto con la foólisis láser-flash de una molécula de nicotina fotoactivable. Permitir la activación precisa de receptores colinérgicos nicotínicos. Esta técnica permite un control espaciotemporal fino sobre la aplicación agonista del receptor nicotínico, proporcionando una poderosa herramienta para el estudio de los patrones de expresión funcional del receptor y la transmisión sináptica colinérgica o de volumen.
Antes de comenzar el procedimiento, utilice un tirador de pipeta programable para tirar de una micropipeta de vidrio con un diámetro de apertura de 20 a 40 micrómetros. Colar aproximadamente un mililitro de solución de grabación a través de un filtro de 0,22 micras. Y resuspendir suficiente nicotina fotoactivable liofilizada en la solución de grabación filtrada para producir una concentración final de dos mililitros.
Rellene la micropipeta de aplicación local tirada con 50 microlitros del medicamento fotoactivable y asegure la pipeta en un soporte de pipeta montado en un micromanipulador. Conecte el soporte de pipeta a través de una longitud adecuada de tubo a un sistema de eyección de presión capaz de una aplicación sostenida de baja presión. Y utilice el micromaniprógrafo para maniobrar la pipeta de aplicación local en la solución de grabación extracelular.
Coloque la punta de la pipeta ligeramente por encima de una muestra de tejido cerebral del ratón, aproximadamente a 50 micrómetros de la célula de interés. Y aplicar brevemente de una a dos libras por pulgada cuadrada de presión a la pipeta. Debe haber un desplazamiento mínimo o ningún desplazamiento de la célula de interés.
Después de lograr una abrazadera de parche de celda entera estable, encienda la aplicación baja en el dispositivo de eyección de presión y sature el tejido que rodea la célula con nicotina fotoactivatable durante uno a dos minutos. La aplicación local introduce complejidad adicional en el experimento. Pero ahorra compuesto y permite que se utilicen concentraciones más altas de PA-Nic.
Para la aplicación de baño de la nicotina fotoactivatable, primero disolver lo suficiente del fármaco liofilizado en un volumen de solución de grabación adecuada para la recirculación continua a una concentración final de 100 micromolares. Y cargue la mezcla resultante en un sistema de perfusión. A continuación, comience la recirculación de la solución fotoactivable de nicotina a una velocidad de 1,5 a 2 milímetros por minuto, utilizando tubos con un diámetro interior mínimo y longitud total para minimizar el volumen de recirculación requerido.
Durante la recirculación, burbuja continuamente la solución con carbógeno, y mantener la temperatura del baño a 32 grados Celsius en condiciones de poca luz. La aplicación de baño se beneficia de la simplicidad y uniformidad de la permeación PA-Nic del tejido. Pero necesariamente utiliza concentraciones más bajas de PA-Nic micromolar, y gasta mayores cantidades totales de compuesto.
Para la visualización en vivo de una neurona de habenula medial, utilice la óptica de contraste de interferencia diferencial de luz o infrarrojo transmitida y una cámara de video para establecer una grabación estable de la abrazadera de parche de células enteras. Después de establecer la configuración conectada a la celda de alta resistencia, pero antes del allanamiento, cambie la configuración y el software al modo de escaneo láser. Después del robo, utilice el escaneo láser para verificar que el tinte de imagen de interés está llenando pasivamente la neurona por difusión.
Deje que el tinte llene los compartimentos celulares durante al menos 20 a 30 minutos antes de utilizar la función de escaneo en vivo para visualizar la neurona y el compartimento subcelular de interés. Seleccione parámetros de imagen que permitan una visualización en vivo precisa de las entidades neuronales, manipulando los ajustes adecuados para afectar o alterar la visualización de la pantalla, la resolución, la relación señal-ruido y el tiempo de adquisición del fotograma de imagen según sea necesario. Para mejorar el contraste de la señal, abra la ventana de la tabla de búsqueda y ajuste los ajustes del suelo y del techo de la mesa de búsqueda.
Para localizar un área de interés dentro del tejido, seleccione el zoom óptico 1X y utilice los controles de panorámica. Utilice la herramienta Serie Z para seleccionar una posición de inicio y parada que contenga la celda de interés. Establezca un tamaño de paso de un micrómetro y seleccione un tamaño de imagen que produzca una imagen de mayor resolución.
A menudo 1, 024 por 1, 024 píxeles por línea. A continuación, imagine consecutivamente la neurona en cada plano Z que contenga la célula. Para calibrar la estimulación láser, inicie el escaneo del sistema con una potencia láser de imagen superior al mínimo y ajuste el enfoque objetivo en la capa de fluorescencia del marcador rojo delgado.
Seleccione un área dentro del campo de fluorescencia libre de escombros y recubierto uniformemente con marcador, y abra las herramientas, la calibración y el menú de alineación para seleccionar la función de galvocalibración sin recuadrán. Siga el tutorial de puntos de quemado para la calibración espacial del segundo par de espejos galvanómetros, seleccionando el láser de 405 nanómetros, una potencia de estimulación láser de 400 y una duración de estimulación de 20 milisegundos. Para producir agujeros de uno a cinco micrómetros de diámetro en el marcador rojo.
Seleccione actualizar para estimular y actualizar la imagen después de la quema del punto central, y mueva el indicador rojo redondo a la ubicación real del punto del centro, el centro derecho y los puntos del centro inferior para obtener una cuadrícula de nueve puntos. Para probar la calibración, abra la ventana de puntos de marca y active manualmente los parámetros de estimulación de los puntos definidos en una nueva área de la muestra, teniendo cuidado de que el archivo de calibración más reciente correcto se cargue en la ventana de puntos de marca. A continuación, aplique un pulso de prueba para verificar la calibración correcta.
Para visualizar brevemente y localizar el área subcelular de interés, seleccione el escaneo en vivo y utilice aumentar el zoom óptico para visualizar cualquier estructura pequeña según sea necesario. Coloque el punto de marca en el punto de mira inmediatamente adyacente a la membrana celular y establezca los parámetros de fotoestimulación en una duración de uno a 50 milisegundos, una potencia láser de uno a cuatro milivatios y al menos un ensayo. A continuación, seleccione los puntos de marca de ejecución para iniciar el protocolo de puntos de marca y observe la adquisición de datos de electrofisiología en tiempo real.
La fluorescencia fotoactivable nicotina 2PE de PA-Nic de un milimolar se detecta fácilmente durante la expulsión de presión de una pipeta de aplicación local como se ha demostrado. Mientras que la entrega de los principales productos fotoquímicos de la reacción fotoactivable de folisis de nicotina no genera ninguna señal fluorescente en la misma concentración y potencia de excitación y longitud de onda. Demostrar la especificidad de los resultados fotoactivables de nicotina.
La imagen de la nicotina fotoactivatable aplicada al tejido cerebral como se ha demostrado revela la presencia del fármaco dentro de 100 a 200 micrómetros de la pipeta de aplicación local. Confirmar que la nicotina fotoactivable puede ser entregada eficazmente al tejido cerebral a través de la aplicación local. Aquí, se muestran imágenes de alta calidad dentro de las cuales la morfología neuronal parece estar completa, el ruido se minimiza y los desechos no interfieren con la interpretación de la morfología celular.
Estas imágenes, sin embargo, son de menor calidad. Debido a una menor relación señal-fondo y a los escombros sustanciales. El emparejamiento de la microscopía de escaneo láser de dos fotones de las neuronas de habenula medial en rebanadas cerebrales con fotólisis láser flash de PA-Nic como se ha demostrado, permite la conciliación de las respuestas electrofisiológicas con la morfología celular.
La folisis de punto único realizada a intervalos de 10 segundos permite un tiempo de recuperación suficiente para la corriente de retención de línea base. Mientras que un intervalo más corto de un segundo conduce a un aumento gradual en la corriente de retención a medida que avanza el protocolo. Sugiriendo que la nicotina no tiene suficiente tiempo para difundirse lejos del sistema con los intervalos más cortos.
Al diseñar experimentos que utilizan moléculas fotoactivables, es importante recordar seleccionar indicadores fluorescentes e informar de fluoróforos con espectros de emisión de excitación compatibles. PA-Nic es compatible con los fluoróforos más comunes debido a su pico de fotólisis de longitud de onda corta. Al elegir la técnica de aplicación PA-Nic más adecuada, es importante considerar cuidadosamente la expresión funcional, actividad fisiológica de los receptores nicotínicos en las neuronas de interés.
La utilización especializada de esta técnica permite un control espaciotemporal fino de la aplicación de la nicotina, lo que permite nuevas y emocionantes posibilidades para estudiar la cinética del compromiso nativo del receptor nicotínico, la localización subcelular y la modulación de la actividad neuronal mediante la activación del receptor nicotínico.
