Cuando una función proteica en particular se modifica mediante la manipulación génica, la coordinación de la insuficiencia irritativa y el deterioro del funcionamiento motor se considera una condición necesaria para la relación causal entre la LTD y el aprendizaje motor. Aquí demostramos el uso de múltiples protocolos para evaluar la LTD que pueden ser inducidos a través de mecanismos compensatorios en animales manipulados genéticamente. Antes de cosechar el cerebro, enfríe y oxigene dos vasos de 50 mililitros de ACSF sobre hielo.
Cuando la temperatura de la solución alcance menos de cuatro grados centígrados, añada 50 microlitros de una tetrodotoxina milimétrica a uno de los vasos fríos. Para cosechar el cerebro, sostenga la cabeza y use tijeras oftalmológicas para cortar la piel superficial a lo largo de la línea media. Retraer manualmente la piel para exponer ampliamente la superficie del cráneo y utilizar las tijeras para cortar a lo largo del cráneo horizontalmente desde el agujero espinocerebeloso principal a justo por encima de los ojos y las orejas antes de cortar el cráneo a lo largo de una línea por encima de ambos ojos.
Usa un bisturí para cortar el cerebro en el centro del cerebro y aislar la parte caudal del cerebro, incluido el cerebelo, del cráneo. Sumerja la muestra en el vaso de precipitados fríos de ACSF y ajuste el tubo de burbujas para que no remueva el bloqueo cerebral en el vaso de precipitados. Después de al menos siete minutos, usa una espátula para recoger el bloqueo cerebral y usa un pedazo de papel de filtro para absorber cualquier exceso de ACSF.
Monte el lado ventral del tejido hacia abajo en una pieza de agar de dos por dos centímetros con un adhesivo médico apropiado. Utilice una cuchilla para cortar el hemisferio derecho del tejido cerebral tan paralelo al plano dendrítico de las células purkinje como sea posible. Cortar y quitar el otro lado del hemisferio y cortar el cerebro entre los colliculi superior e inferior.
Cortar la médula espinal y pegar el lado derecho del cerebelo recortado con el bloque de agar en la bandeja de muestra pre-refrigerada. A continuación, inclinando la bandeja de la muestra, vierta ACSF sobre la muestra para fijar el tejido y lavar cualquier exceso de pegamento. Para cortar la muestra del cerebro, orientar la muestra de tal manera que el lado dorsal del cerebelo esté en la parte delantera y vierta suficiente del corte en frío con ACSF complementado con tetrodotoxina para sumergir completamente el cerebelo.
Coloque un tubo de gas en la solución de corte e inicie el burbujeo con una mezcla de gas de dióxido de oxígeno y carbono. Usando pinzas finas y lupas, retire el mater aracnoideo e excime el pedúnculo cerebeloso. Después de retirar el tronco encefálica y el bloque de agar, gire la bandeja 180 grados para que la superficie dorsal del cerebelo se enfrente a la cuchilla de afeitar del vibratoma y ajuste la primera ubicación de corte.
Establezca la amplitud del vibratomo en 5,5 y la frecuencia en 85 Hertz, la velocidad de tres a cuatro y el grosor de la rebanada en 300 micrómetros. A medida que se obtienen las rodajas de cerebeloso, utilice una red de nylon para transferir las secciones a una incubadora de acrílico en un baño de agua de 26 grados centígrados y sumerja completamente las muestras en ACSF fresco oxigenado durante al menos una hora. Para informes de abrazaderas de parches de células enteras, disuelva una picrotoxina micromolar en ACSF por ultasonicción durante tres minutos antes de perfundir una cámara de grabación de 30 grados centígrados con la solución de toxina a un caudal de dos mililitros por minuto.
Después de unos minutos, transfiera una rebanada cerebelosa a la cámara de grabación y fije el tejido con un peso de platino y hilos de nylon. A continuación, llene un electrodo estimulante con ACSF fresco. Para estimular las fibras paralelas, coloque el electrodo estimulante en la superficie de la capa molecular a unos 50 micrómetros de la capa celular de Purkinje.
Para la estimulación de las fibras de escalada, coloque el electrodo estimulante en la parte inferior de la capa celular de Purkinje y utilice un microcargador para llenar un electrodo de grabación con ocho microlitros de 0,45 micrómetros filtrados de potasio o cesio a base de solución interna. Aplique una presión positiva débil al electrodo de grabación antes de sumergir el electrodo en el ACSF. La resistencia del electrodo debe ser de dos a cuatro megaohms y se debe corregir el potencial de unión líquida.
Acérquese al cuerpo celular brillante sano de una célula de Purkinje con el electrodo de grabación y empuje ligeramente la superficie de la célula de Purkinje. A continuación, deje de aplicar la presión positiva y aplique presión negativa hasta que se forme un sello de gigaohm. A continuación, utilice la presión negativa para establecer una configuración de célula completa, manteniendo el potencial de membrana en menos 70 milivoltios y aplicando un pulso de menos dos milivoltios de 100 milisegundos a 0,1 hercios, monitoreo continuo de la resistencia de entrada, resistencia en serie y capacitancia de entrada.
Para la inducción de la depresión a largo plazo, estimule la capa molecular con un pulso de 0,1 milisegundos y aplique un estímulo de doble pulso para identificar las corrientes postsinápticas excitatorias de fibra paralela. Se debe observar una facilitación del pulso emparejado y un aumento gradual de la amplitud en relación con el aumento de la intensidad de la estimulación. Para registrar la respuesta de la prueba, aplique un solo pulso de hercio 0,1 y ajuste la intensidad del estímulo de modo que la amplitud evocada sea de alrededor de 200 picoamps.
Estimular las fibras de escalada en la parte inferior de la capa celular de Purkinje e identificar las corrientes post-sinápticas excitatorias de fibra paralela provocadas por la activación de la fibra de escalada, aplicar un estímulo de doble pulso. Se debe observar una depresión del pulso emparejado de una manera total o nula en correlación con el aumento de la intensidad de la estimulación. En este experimento representativo, se utilizó una conjunción de una estimulación de fibra paralela y una estimulación de fibra de escalada en condiciones de abrazadera de corriente para la preparación de la rebanada.
La forma de la espiga compleja provocada por la estimulación coyunta fue similar a la provocada por la estimulación de la fibra de escalada solo con la primera espiguilla empinada seguida de dos o tres espiguillas. Se observó un pico complejo de forma similar cuando una estimulación de fibra paralela fue seguida 50 milisegundos más tarde por una segunda estimulación paralela y de fibra de escalada. En esta prueba bajo condiciones de abrazadera de voltaje utilizando una solución interna basada en cesio, una estimulación de fibra paralela fue seguida 50 milisegundos más tarde por una aplicación concomitante de una segunda estimulación de fibra paralela y despolarización somática.
Una corriente interna se provocó sobre la despolarización somática de menos 70 a cero milivoltios y la corriente de cola también se evocó después de la repolarización. Finalmente, cinco estímulos de fibra paralela a 100 hercios se dieron simultáneamente con la despolarización somática bajo condiciones de abrazadera de tensión. Una vez más, una generación repetitiva de corrientes interiores se provocó durante la despolarización y la corriente de cola fue inducida después de la repolarización.
Para evaluar la relación entre la LTD cerebelosa y el aprendizaje motor en animales manipulados genéticamente, se deben utilizar múltiples protocolos para inducir LTD en condiciones fisiológicas acogedoras. Si la LTD cerebelosa se visualiza en animales manipulados genéticamente después del aprendizaje motor, la relación causal entre ellos puede examinarse más directamente.
