El objetivo de este método es identificar la conectividad funcional de las entradas de largo alcance de regiones cerebrales distantes utilizando la fotosestimulación en las rebanadas cerebrales. La segmentación estereotáctica de una región cerebral específica para diversas expresiones mediadas de canales iónicos sensibles a la luz permite la estimulación selectiva de axones procedentes de esa región con luz. Demostrando el procedimiento estará Louis Richevaux, un estudiante de doctorado de mi grupo.
Antes de la cirugía, verifique que el animal esté bien anestesiado con un pellizco en el dedo del dedo del dedo. Tire suavemente de su lengua para facilitar la respiración. Luego, afeita el pelo craneal.
Inyectar 20 microlitros de clorhidrato de lidocaína bajo la piel de la cabeza para anestesia local y esperar cinco minutos. Para exponer el cráneo, haz un corte en el cuero cabelludo. A continuación, coloque el animal en un marco estereotaxico.
Inserte las barras de las orejas y descanse en los huesos ligeramente rostrales en las orejas y tire hacia abajo de la piel para crear un buen acceso al cráneo. Apriete las barras de las orejas e instale la pieza de la nariz. Mantener el cuerpo del animal horizontalmente y al nivel de la cabeza usando un soporte ajustado a la altura.
Coloque una almohadilla de calentamiento debajo del animal para mantenerla a temperatura fisiológica. Luego limpie el cráneo aplicando 0.9%cloruro de sodio con un hisopo de algodón para eliminar el tejido blando. Ajuste el cráneo para que el acceso a bregma lambda esté nivelado.
A continuación, localice el lugar de inyección en el cráneo de acuerdo con las coordenadas posterior y medial y coloque la aguja de inyección por encima de él. Marque el cráneo con una aguja desechable. Posteriormente, mueva la aguja de inyección hacia arriba por cuatro centímetros.
Usando una rebaba de 0,5 milímetros, crea una craneotomía de un milímetro de diámetro en la marca a la mitad de la velocidad máxima. Swab con un tejido si se produce algún sangrado. A continuación, vacíe el agua contenida en la jeringa de Hamilton para almacenarla expulsándola completamente con una bomba.
Sólo la aguja está llena de agua. Descongelar la solución viral que se va a inyectar sobre hielo, a continuación, retirar brevemente del hielo y obtener 700 nanolitros de la solución con una micropipeta. A continuación, deposite una gota en una película de parafina.
Coloque la película de parafina encima de la craneotomía. Sumerja la aguja en la gota de solución viral sin cambiar el anteroposterior y la posición lateral. Después, utilice la función de retirada de la bomba para llenar la jeringa con unos 500 nanolitros de la solución viral en la película de parafina.
Realice este procedimiento bajo el estereoscopio, vea la caída desapareciendo y asegúrese de no aspirar ningún aire. Asegúrese de que la jeringa se ha llenado correctamente. Pruebe el sistema de eyección conduciendo por el émbolo para probar la expulsión de una pequeña gota de líquido.
Posteriormente, inserte la aguja en el cerebro a la profundidad elegida. Pulse el botón de ejecución para la inyección. Luego, retire lentamente la aguja durante tres a cinco minutos.
Lave inmediatamente la aguja en agua destilada limpia llenándola varias veces para evitar obstrucciones. Después, retire el animal del marco estereotaxico. Suturar la piel y hacer tres o cuatro puntos de sutura atados con 2-1-1 nudos quirúrgicos estándar.
Para extraer el cerebro, haz un corte en la piel desde el cuello hasta la nariz, luego secciona las últimas vértebras del cráneo con tijeras. Retirar la piel y cortar el cráneo a lo largo de la línea media de la dirección caudal a rostral. Retire cuidadosamente el hueso parietal y la parte caudal del hueso frontal.
Extrae el cerebro con una pequeña espátula redondeada insertándola entre el cerebro y el suelo craneal, secando el bulbo olfativo, el nervio óptico y otros nervios craneales y el cerebelo. Sumerja suavemente el cerebro en una solución de corte por frío. Posteriormente, transfiera el cerebro a un papel de filtro y seque suavemente la superficie cortical.
Pegue la corteza cerebral al soporte de la muestra de un vibratome con el lado caudal mirando a la hoja para cortar las rebanadas horizontales del cerebro. A continuación, llene la cámara de corte con solución de corte oxigenado con hielo frío para que el cerebro esté completamente sumergido. Sección 300 micrometros de espesor con el vibratome a una velocidad de 07 milímetros por segundo a una amplitud de un milímetro.
En esta etapa, se recomienda comprobar brevemente la expresión Chronos-GFP en el tálamo utilizando una linterna fluorescente y las gafas de filtro correspondientes. Para realizar la grabación de la abrazadera de parche de célula entera, transfiera suavemente una rebanada cerebral que contenga el complejo del hipocampo a la cámara de grabación. Perfunde continuamente la cámara de grabación con 34 grados Celsius ACSF burbujeado con carisógeno a dos o tres mililitros por minuto.
Examine brevemente la expresión Chronos-GFP en terminales axon en la región de interés con iluminación LED azul a aumento 4X. Cambie a un objetivo de inmersión 63X y ajuste el enfoque. Compruebe si hay axones que expresen Chronos-GFP y elija una neurona piramidal para la grabación de parches.
A continuación, llene una pipeta con solución interna a base de gluconato de potasio. Montarlo en el soporte de pipeta en el escenario de la cabeza. Parchee la celda en la configuración de la abrazadera de voltaje.
Acérquese a la neurona identificada y presione delicadamente la punta de la pipeta sobre el soma. La presión positiva debe producir un hoyuelo en la superficie de la membrana. A continuación, suelte la presión para crear un sello gigoOm.
Una vez sellado, ajuste la tensión de retención a menos 65 milivoltios. Romper la membrana con un fuerte pulso de presión negativa. Registre las respuestas de la neurona a los pasos actuales hiperpolarizantes y despolarizantes en el modo de abrazadera de corriente de célula entera.
Registre en la abrazadera de corriente o voltaje las respuestas postsinápticas a la estimulación de campo entero LED de 475 nanómetros de fibras aferentes que expresan Chronos. Estimular con trenes de diez estimulaciones de dos milisegundos de duración a 20 hercios. La actividad de las neuronas presubiculares en la capa tres en respuesta a los pasos actuales hiperpolarizantes y despolarizantes se registró en la configuración de la abrazadera de parche de célula entera.
Estimular los terminales de axón ADN que expresan Chronos-GFP provocó potenciales postsinápticos excitatorios en la capa presubicular tres células principales en el modo de abrazadera actual. Dependiendo de la intensidad de la luz, los EPSP podrían alcanzar el umbral potencial de acción. También se observaron respuestas postsinápticas en el modo de abrazadera de voltaje, ya que se provocaron corrientes postsinápticas excitatorias.
Aquí se muestra una neurona piramidal de tres capas rodeadas de axones talámicos que expresan Chronos-GFP en capas superficiales presubiculares con tinción DAPI con un microscopio de epifluorescencia. Y esta imagen fue tomada con un aumento más alto con un microscopio confocal. Nivelación cuidadosa del bregma a lo largo del eje en la realización de experimentos piloto con un trazador fluorescente son cruciales para mejorar la precisión de la inyección estereotaxica.
Este procedimiento también se puede utilizar para investigar proyecciones convergentes de diferentes áreas mediante la inyección en dos escenas generativas sensibles a dos longitudes de onda diferentes. El desarrollo de esta técnica ha permitido un análisis preciso de circuitos anatómicos y funcionales entre regiones cerebrales distantes de una manera específica de tipo celular.
