Aquí describimos un protocolo que emplea inmunofluorescencia, microscopía confocal y análisis basado en computadora para determinar la distribución de proteína sináptica en relación con una proteína de referencia. Nuestro método elude la variabilidad inherente de las tinciones de inmunofluorescencia mediante el uso de una relación en lugar de niveles absolutos de fluorescencia. Además con este método se puede analizar la heterogeneidad de la distribución de proteínas en diferentes niveles.
Desde rebanadas de cerebro enteros hasta regiones cerebrales e incluso subregiones como las diferentes capas del hipocampo. Esta técnica se puede adaptar para determinar la distribución de proteínas en diferentes tejidos distintos del cerebro y sistemas modelo distintos de los ratones. Comience lavando el cerebro de ratón previamente aislado y fijo como se describe en el manuscrito.
Luego transfiera el cerebro a un tubo de reacción de 15 mililitros con 30%sacarosa 0.1 molar PB. Para proteger el cerebro incubarlo a 4 grados centígrados durante 48 horas o hasta que se hunda. Después de eso, usa una cuchilla afilada para recortar el cerebro protegido crio, dependiendo del área de interés. A continuación, coloque el cerebro en un molde crio y agregue el compuesto de temperatura de corte óptimo para incrustarlo asegurándose de evitar burbujas y orientar el cerebro correctamente para tener un plano coronal de corte.
Coloque el molde crio en el congelador de menos 80 grados centígrados hasta que esté congelado. Montar el tejido congelado en el microtoma crio y esperar al menos 15 minutos antes de la sección para equilibrarlo a la temperatura del microtomo. Comienza a cortar el cerebro en rodajas coronales de 25 micrómetros de espesor.
Use un gancho de vidrio al PTU de la primera rebanada cuidadosamente sin tocar el tejido cerebral. El OCT se pegará al gancho de vidrio. Usa el gancho de vidrio para transferir la rebanada cerebral al primer pozo.
Recoger tres rodajas adyacentes por pozo en una placa de 24 pozos llena con 0.1 molar PB. Almacene las rodajas a cuatro grados centígrados hasta que se manche durante un máximo de dos semanas. Para preparar las rodajas para la inmunomancha, utilice una pipeta de plástico para eliminar la solución de PB de un pozo sin dibujar en las rebanadas cerebrales. A continuación, utilice un pipeteo de 1000 micro litros para agregar 250 microlitros de PB fresco para lavarlos de exceso de OCT.
Repita este lavado para cada pozo en el momento para evitar secar las rodajas. A continuación, utilice una pipeta de plástico para quitar la solución PB del primer pozo. Utilice una pipeta de microlitros de 1000 microlitros para agregar 250 microlitros de búfer de bloqueo por pozo que funcionan bien de nuevo.
Incubar la placa a temperatura ambiente en una coctelera durante tres horas. Durante la incubación añadir 250 microlitros de tampón de anticuerpos por pozo a un tubo de reacción. A continuación, utilice una pipeta de 2 microlitrotro para agregar la cantidad adecuada de anticuerpos pipetándolo directamente en la solución y suavemente pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar.
A continuación, vórtice este anticuerpo diluido para no asegurar la mezcla adecuada. Funcionando bien quitando bien el tampón de bloqueo con una pipeta de plástico y agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos primarios por pozo. Incubar el plato en una coctelera a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente retire la solución de anticuerpos con una pipeta de plástico. Lavar las rodajas con 300 microlitros de tampón de lavado uno por pozo tres veces diez minutos cada uno lavar en una coctelera a temperatura ambiente. Durante el lavado, trabajando en la oscuridad, diluir el flúor para un par de segundos anticuerpos en un tubo de reacción de la misma manera que se hacía anteriormente con el anticuerpo primario.
Después de completar el lavado, retire el tampón de lavado con una pipeta de plástico y agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos secundarios por pozo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de la incubación completa, retire la solución de anticuerpos con una pipeta de plástico.
Lave las secciones tres veces con el tampón de lavado dos de la misma manera que con la tampón de lavado uno. Durante este lavado diluye la mancha DAPI en 0,1 MOLar PB para lograr una concentración de uno a 2000. Después de retirar el tampón de lavado de la placa añadir 250 microlitros de solución DAPI e incubar a temperatura ambiente en la coctelera durante 5 minutos.
Después de retirar la solución DAPI con una pipeta de plástico, utilice una pipeta de 1000 microlitros para agregar 500 microlitros de 0,1 MOLar PB por pozo. Coloque una diapositiva de microscopio debajo de un estereoscopio. Utilice un cepillo fino para agregar tres gotas separadas de 0.1 molar PB en la diapositiva.
Usando el pincel coloque un corte por gota en la diapositiva y luego aplane y oriente los rodajas. Después de que todas las rodajas se colocan correctamente, utilice un pañuelo de papel para eliminar el exceso de PB y seque cuidadosamente sin secar las rodajas por completo. A continuación, agregue 80 microlitros de medio de incrustación en la diapositiva y cúbralo cuidadosamente con un resbalón de cubierta para incrustar las rebanadas cerebrales.
Cubra los portaobjetos para evitar la exposición a la luz y déjelos secar en la campana de humos durante una o dos horas y luego guárdelos en una caja deslizante de microscopio a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para la microscopía confocal. Después de adquirir tejidos virtuales de toda la rebanada del cerebro para diferentes canales como se describe en el manuscrito, cargue todos los canales individuales o una imagen en FIJI haciendo clic en el archivo y luego abra. A continuación, utilice la herramienta de selección de manos libres para delinear un hemisferio en el canal DAPI.
Haga clic en editar, luego seleccione y, a continuación, cree una máscara para crear una máscara de la región seleccionada. A continuación, haga clic en analizar y luego medir partículas para determinar la intensidad media de fluorescencia para canales individuales. Asegúrese de seleccionar canales individuales para determinar los valores medios de intensidad de fluorescencia para cada canal.
Después de eso, copie la intensidad media de fluorescencia para los canales individuales en una hoja de cálculo. Para determinar la intensidad media de fluorescencia para los canales individuales en un área de interés, defina el área con la herramienta de selección de manos libres. Después de la tinción con DAPI que mancha los núcleos secciones cerebrales tienen un patrón de punctada y las regiones con alta densidad celular son más brillantes que las regiones con baja densidad celular.
La tinción con anticuerpos Mover reveló una distribución heterogénea con áreas de puntos calientes brillantes y áreas de atenuación en todo el cerebro donde como Synaptophysin reveló una distribución más homogénea. Una superposición de imágenes mostró la distribución diferencial de la fluorescencia roja que indicaba la proteína Mover comparada con la fluorescencia verde que indica sinaptofísica. Después del análisis de cuantificación, se han determinado valores de intensidad de fluorescencia medios para diferentes canales a través de los hemisferios y en todas las áreas de interés para Mover y Sinaptophysin.
Las proporciones de los valores de fluorescencia del motor con respecto a los valores de fluorescencia de sinaptofisina muestran la distribución heterogénea de Mover con áreas de niveles de Mover altos y bajos en relación con las vesículas sinápticas. Abundancia relativa de Mover la relación en un área de interés en comparación con la de todo el hemisferio y traducido en un porcentaje mostró la cantidad de Mover está presente en un área de interés en relación con el promedio. La abundancia relativa de Mover se determinó para diferentes capas en los subcampos del hipocampo.
Las tres regiones de interés se cuantifican comparando la relación en las capas respectivas con la relación del hemisferio correspondiente. Este procedimiento se puede adaptar y combinar fácilmente con diferentes técnicas de imagen, como la microscopía de super resolución para determinar adicionalmente la distribución subcelular de la proteína de interés. Esta técnica también se puede aplicar a diferentes sistemas modelo, como animales modificados genéticamente o tratados con medicamentos.
Esto puede permitir un enfoque comparativo a través de diferentes condiciones experimentales o incluso especies.
