A Grant PHS (MH51393) apoya este trabajo. Algunos de los Aplysia que utilizamos son proporcionados por el Nacional de Recursos para Aplysia, de la Universidad de Miami con la subvención RR10294 del Centro Nacional para Recursos de Investigación, NIH.

1. Preparación <ol><li> Se anestesia el animal mediante la inyección de 75-100 ml de solución isotónica de cloruro de magnesio. El Aplysia que utilizamos para formación de imágenes son generalmente 150-200 gramos y se obtienen a partir Marinus Scientific. </li><li> Pin el animal anestesiado a un plato cubierto de cera. Agujas de jeringa funcionan bien para este propósito; técnicas estériles no son necesarios. Con unas pinzas y tijeras brutos estándar hacen una incisión en la pata del animal y exponer la masa bucal. Localice el ganglio vestibular. Con unas tijeras y pinzas de resorte fino, cuidadosamente gratis el ganglio cortando todos los nervios vestibulares. </li><li> Retire el ganglio y colóquelo en un plato Sylgard recubierto que contiene agua de mar artificial. Coloque unas pocas pins del insecto a través de los nervios vestibulares para estabilizar el ganglio. Desheath el ganglio vestibular usando fórceps y tijeras ultrafinas de resorte, a fin de exponer las neuronas para el registro intracelular. Después, vuelva a fijar el ganglio utilizando aproximadamente 15 insectos fino (minutien pins). El ganglio debe mantenerse firme en su lugar ya que cualquier movimiento será problemático durante la exploración. </li></ol> 2. Preparar Electrodos <ol><li> Tire electrodos utilizando tubería capilar de vidrio con filamento (por ejemplo WPI TW100F-4) y un extractor. Esta configuración debe ser determinado individualmente para crear electrodos de la resistencia requerida. Cuando se llena con 3 M KAc (acetato de potasio) nuestra resistencia del electrodo es generalmente de aproximadamente 10 MOhms si los electrodos están a achaflanar, o aproximadamente 5 MOhms si el paso de biselado se omite. </li><li> Llenar un conjunto de electrodos con una solución que contiene 3 M KCl KAc/30 mM utilizando una jeringa y aguja microfil. Estos electrodos se utilizan para electrofisiología. </li><li> Llenar un segundo conjunto de electrodos con el colorante indicador de calcio mediante la inmersión del extremo posterior del electrodo en tinte, previamente reconstituidos con aprox. 40 l de agua destilada para tinte 500μg. Cuando la punta del electrodo se ha llenado, de nuevo llenar aproximadamente 1/4 pulgadasdel extremo del electrodo con 200 mM KCl para asegurar un buen contacto eléctrico. </li><li> Es beneficioso para biselar los electrodos, ya que esto facilita la inyección de tinte y reduce el daño causado por las penetraciones de membrana múltiples. Usamos un biselador habitual que genera una corriente de una suspensión de sal en polvo agua / alúmina. El electrodo se monta en un soporte y su punta penetra en la corriente en un ángulo de 45 °. La resistencia del electrodo se controla continuamente y se termina el biselado cuando la resistencia alcanza aproximadamente 5 MOhm para electrodos KAC llenos. Los electrodos de tinte llenas están biselados para una cantidad igual de tiempo y típicamente tienen resistencias de MOhm 15-20. </li></ol> 3. Carga del tinte indicador de calcio <ol><li> Colocar la preparación en una plataforma de electrofisiología y localizar visualmente la neurona presináptica de interés. Muchos de nuestros experimentos se hacen con una neurona sensorial identificado utilizado durante la alimentación, B21 5, 6. La positio relativamente fijon, el tamaño (~ 100 m), y la forma alargada del soma B21 hacen que sea fácil de localizar. </li><li> Empalar la neurona de interés con un electrodo que contiene el colorante indicador de calcio. Identidad B21 puede ser verificada por empalar el post-sináptica de neuronas B8. La despolarización de B21 con ~ 8 nA actual dará lugar a picos y el resultado en la facilitación de PSPs en B8 7. </li><li> Inyectar material de contraste en la neurona presináptica de interés al pasar impulsos de hiperpolarización (típicamente -15 nA, 1 Hz, 75% del ciclo de trabajo) durante aproximadamente 30 minutos. Si la carga de colorante tiene éxito, el soma de la neurona adquiere un color rosa pálido. Retire el electrodo que contiene el colorante lentamente se retiraba de la neurona. </li><li> Deja preparativos para aproximadamente 30 minutos para permitir que el tinte se difunda en los procesos finos que hacen contacto sináptico con las neuronas del seguidor. </li></ol> 4. El calcio de imágenes y grabación electrofisiológica <ol><li> Colocar la preparación en la imagen microscope. El plato de la preparación se lleva a cabo en una plataforma de refrigeración con trozos de cable sellado Permagum que, a diferencia de arcilla, sigue siendo pegajoso cuando está húmedo. El microscopio de platina fija centra moviendo el objetivo. La etapa permanece estacionario, lo que permite fijar manipuladores imán montado. Como la gran amplificación hace vibraciones (movimiento lateral especialmente) un problema, la configuración de imagen completa debe ser colocado en una plataforma de aislamiento de vibraciones. </li><li> Empalar neuronas presinápticas y postsinápticas con electrodos que contienen solución electrolítica normal. </li><li> Seleccione un bloque de filtro adecuado para Calcio imagen Orange (excitación 549 nm, emisión 576 nm) 8 y ajustar la cámara. La mayoría de las cámaras CCD científicos permite al investigador elegir un subconjunto de celdas CCD que se leen. Además, las células se pueden combinar (agrupaciones). Selección de un subconjunto más pequeño aumenta la velocidad, mientras que hurgar en la basura aumenta la sensibilidad. Estas dos configuraciones, junto con el tiempo de exposición, determinarla velocidad de fotogramas es decir, cuántas imágenes se pueden adquirir por segundo. Ajustes adecuados tomará imágenes de un área de 580 x 350 m 2 con 500 x 300 píxeles (usando un lente de 10x y un adaptador de cámara 0.5x). Añadir filtros de densidad neutra para la trayectoria de la luz para ajustar la intensidad de la iluminación a la cantidad mínima que proporciona una exposición correcta con un tiempo de exposición &lt;25 ms. Estos ajustes deben resultar en una velocidad de alrededor de 30 Hz - que en Aplysia es lo suficientemente rápido para una sola imagen pico evocados alteraciones de calcio. Finalmente, cierre la abertura campo de manera que sólo el área de la imagen se ilumina. </li><li> En el software de imágenes de marcar regiones de las neuronas que desea medir. En el software de Elementos AR esto se hace en la &quot;Medición de la hora&quot; mediante la colocación de regiones de interés (ROIs). B21 es una neurona bipolar y el trabajo previo ha demostrado que sus contactos proceso lateral de la neurona postsináptica de interés 9. Por lo general, la imagen principal sostén, secundaria y terciarianches del proceso lateral mediante la colocación de una ROI en cada parte de la neurona. Un ROI adicional junto a la neurona colorante llena se mide para proporcionar un valor de fondo que es posteriormente restado de todos los demás puntos de datos. </li><li> Instruir a la adquisición de electrofisiología (en estos experimentos II Spike) para esperar una señal de activación proporcionada por la &quot;lectura marco&quot; de la señal de la cámara. Inicie la adquisición de la imagen (Elementos AR); Espiga II ahora se inicia automáticamente la grabación cuando la cámara realiza su primer cuadro. También puede utilizar una salida TTL del Poder 1401 a referirme brevemente a un LED montado en el puerto de la cámara del microscopio. Esto proporcionará una señal para sincronizar posteriormente formación de imágenes y datos electrofisiológicos. </li><li> Estimular la neurona presináptica mediante la inyección de una serie de breves pulsos de corriente de despolarización a la frecuencia deseada. Es importante controlar cada pulso (por ejemplo, con un osciloscopio de estímulo desencadena) para determinar si un potencial de acción es successfUlly generado. Mientras que Orange calcio es muy foto-estable en comparación con otros tintes, es una buena idea grabar un ensayo de control sin estimulación para comprobar la cantidad de tinte blanqueamiento ocurre. </li><li> En experimentos en los que las concentraciones de calcio intracelular son manipuladas, un fármaco tal como EGTA se introduce en la neurona presináptica y los pasos de adquisición de estimulación y datos descritos anteriormente se repiten. </li></ol> 5. Análisis de los datos representativos <ol><li> Exportar los datos de imágenes (la lista de valores de intensidad medidos para cada ROI) al escribir en un archivo de texto. Un script personalizado de Spike II continuación, puede importar el archivo de texto. Este script también normaliza los valores con zona de la sonda individuo, y resta el valor de la sonda de fondo. Los puntos de datos se representan a continuación junto con los datos de electrofisiología como un &quot;virtual RealWave&quot; canal. El &quot;canal de proceso / función de cambio de hora&quot; de Spike II se utiliza para alinear con precisión los datos de imágenes points, ​​utilizando la señal de LED como referencia. </li><li> Para obtener los valores como porcentaje de cambio, analizar los datos de imagen mediante el cálculo de la variación relativa de la fluorescencia como dF / F o = (FF o) / o F. F O denota el nivel de fluorescencia justo antes del estímulo y F la fluorescencia durante el estímulo. </li></ol> 6. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema general del experimento. Los experimentos se llevan a cabo en una preparación de ganglio de Aplysia. Los cambios en el calcio intracelular se crean imágenes con un colorante fluorescente, que se iontoforéticamente introducido en la neurona presináptica. Neuronas pre y postsinápticos son entonces empalado con electrodos afilados de modo que la transmisión sináptica puede inducirse y monitoreados. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <strong&gt; Figura 2. imágenes de calcio y registro intracelular de las neuronas identificadas en el ganglio vestibular de Aplysia. (A) Foto de la rama lateral formado la imagen de la neurona B21. El cuadro indica la región medido de interés. (B1) la estimulación intracelular de B21 evoca potenciales de acción (traza inferior) y la facilitación de los potenciales postsinápticos (PSP) en la neurona postsináptica seguidor B8 (centro de seguimiento) provocando que se dispare también los potenciales de acción. El aumento de la fluorescencia de calcio presinápticos se muestra en el trazo superior. (B2) Efecto de EGTA en la facilitación presináptica homosináptica. EGTA se inyectó intracelularmente en B21 ~ 15 minutos antes de la estimulación intracelular. Se cree que EGTA es un quelante de calcio de acción lenta, que en concentraciones bajas no es lo suficientemente rápido para suprimir la transmisión sináptica. Tenga en cuenta la reducción en la señal de calcio generalizada y la correspondiente disminución en la amplitud de PSP. (C) La amplitud de PSP se correlaciona con la calciu presinápticam señal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

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	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Demostramos técnicas que se pueden utilizar para monitorear simultáneamente la concentración de calcio intracelular y evaluar la eficacia de la transmisión sináptica. Estas técnicas son útiles para determinar cómo las diversas formas de plasticidad a corto plazo están mediadas. La formación de imágenes se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia y cámara CCD. Estos requerimientos de equipo son relativamente modestos en comparación a la mayoría de neuroimagen funcional s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Calcio Orange </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calibración de calcio tampón kit </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> útil para probar la sensibilidad y el rango dinámico de la señal </td></tr><tr><td> Magnesio hexahidrato de cloruro </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilizado en solución 0,33 M de anestesiar a los animales </td></tr></tbody></table> Reactivos Tabla 1. Utilizado. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> FN-1 microscopio de fluorescencia vertical </td><td> Nikon Instruments </td><td> con Narishige ITS-FN1 etapa </td></tr><tr><td> NMN-21 manipuladores </td><td> Narishige </td><td> montado en el escenario con imanes </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD cámara </td><td> Fotometría </td><td></td></tr><tr><td> NIS elementos AR (Versión 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> software de imágenes utilizados para adquirir datos de fluorescencia </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor objetivo </td><td> Nikon Instruments </td><td> esta lente de inmersión en agua tiene una muy larga distancia de trabajo de 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lámpara de halogenuro metálico PC </td><td> EXFO </td><td> utilizado para las imágenes por fluorescencia </td></tr><tr><td> LS-DWL lámpara halógena </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 Juego de filtros </td><td> Tecnología Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> Poder 1401 convertidor A / D </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> se realizaron muestreos de 3 kHz </td></tr><tr><td> Espiga II (Versión 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> software utilizado para adquirir datos de electrofisiología </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificador </td><td> NPI electrónica </td><td> se utiliza con un headstage 10 veces </td></tr><tr><td> Modelo 410 amplificador </td><td> Brownlee precisión </td><td> utilizados para amplificar y filtrar la señal </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> menos k Tecnología </td><td> aislamiento de vibraciones para formación de imágenes </td></tr><tr><td> mesa de enfriamiento </td><td> encargo </td><td> placa de latón a través del cual se bombea agua de hielo a una tasa variable </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Equipo utilizado.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Se ha sugerido que los cambios en el calcio intracelular mediar la inducción de un número de importantes formas de plasticidad sináptica (por ejemplo, facilitación, homosináptica) 1. Estas hipótesis pueden ser probadas por monitorizar simultáneamente los cambios en el calcio intracelular y alteraciones en la eficacia sináptica. Se demuestra cómo esto se puede lograr mediante la combinación de imágenes de calcio con técnicas de grabación intracelulares. Nuestros experimentos se llevan a cabo en un ganglio vestibular del molusco Aplysia californica. Esta preparación tiene una serie de características ventajosas experimentalmente: Ganglios puede ser fácilmente eliminado de Aplysia y experimentos utilizar neuronas adultas que hacen conexiones sinápticas normales y tienen una distribución de canales de iones normal. Debido a la baja tasa metabólica del animal y las temperaturas relativamente bajas (14-16 ° C) que son naturales para Aplysia, preparaciones son estables durante largos períodos de tiempo. ent &quot;&gt; Para detectar cambios en el calcio libre intracelular que utilizaremos la versión celular de calcio impermeant Orange 2, que es fácilmente &#39;cargado&#39; en una neurona a través de iontoforesis. Cuando este tinte fluorescente de longitud de onda larga se une al calcio, aumenta la intensidad de fluorescencia. calcio Orange tiene propiedades cinéticas rápidas 3 y, a diferencia de los tintes proporcional (por ejemplo, la Fura 2), no requiere rueda de filtros para imágenes. Es bastante estable y menos foto fototóxica que otros colorantes (por ejemplo, fluo-3) 2,4. Al igual que todos los no-radiométrico colorantes, Calcium Orange indica cambios relativos en la concentración de calcio. Pero, debido a que no es posible tener en cuenta los cambios en la concentración de colorante debido a la carga y difusión, no puede ser calibrado para proporcionar concentraciones absolutas de calcio. Una posición vertical, fijo microscopio etapa, el compuesto se utilizó para las neuronas de imagen con una cámara CCD capaz de grabar alrededor de 30 fotogramas por segundo. En Aplysia esta resolución temporales más que suficiente para detectar incluso un único pico de la alteración inducida en la concentración de calcio intracelular. Electrodos afilados se utilizan simultáneamente para inducir y registrar la transmisión sináptica en las neuronas identificadas pre y postsinápticos. Al final de cada ensayo, un script personalizado combina electrofisiología y los datos de imagen. Para asegurar la sincronización adecuada se utiliza un pulso de luz de un LED montado en el puerto de la cámara del microscopio. La manipulación de los niveles de calcio presinápticos (por ejemplo, mediante inyección intracelular EGTA) nos permite poner a prueba hipótesis específicas, en relación con el papel del calcio intracelular en la mediación de las distintas formas de plasticidad.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Se demuestra cómo los cambios en la concentración de calcio libre intracelular y la eficacia sináptica puede controlarse simultáneamente en una preparación de ganglio<em&gt; Aplysia</em&gt;. Nosotros imagen calcio intracelular usando un colorante fluorescente, naranja calcio, e inducir y controlar la transmisión sináptica con afilados (intracelular) electrodos.

Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

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Research

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K vistas.  Mt. Sinai School of Medicine. Se demuestra cómo los cambios en la concentración de calcio libre intracelular y la eficacia sináptica puede controlarse simultáneamente en una preparación de ganglio Aplysia. Nosotros imagen calcio intracelular usando un colorante fluorescente, naranja calcio, e inducir y controlar la transmisión sináptica con afilados (intracelular) electrodos.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Investigación

Neurociencias

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

Carga de un tinte de calcio en las terminaciones nerviosas de las ranas a través del tocón nervioso: Registro de transitorios de calcio en la unión neuromuscular de la rana

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.