Estudiar el microambiente tumoral es difícil debido a su complejidad. Hemos desarrollado microambientes microarrays que consisten en microambientes combinatorios simples que permiten la identificación de los principales factores conductores de fenotipos de células tumorales. La principal ventaja de la plataforma MEMA es que debido a que todas las condiciones de microambientes están definidas, es sencillo identificar los factores de microambientes que impulsan los fenotipos de interés.
La plataforma MEMA es ampliamente aplicable en otros sistemas no cancerosos, incluyendo cepas de células primarias y células madre. Hay una serie de trucos y pasos de ingeniería que hemos desarrollado para acelerar el trabajo de banco húmedo y simplificar el protocolo. Para comenzar, utilice una impresora de pines táctiles para imprimir la mezcla de impresión de matriz extracelular en puntos fiduciarios en placas de ocho pozos.
Utilice pines de 350 micrómetros de diámetro dispuestos en una configuración de cabezal de impresión cuatro veces siete para imprimir la matriz extracelular para los microarrays de microambiente. El bloque de colágeno se imprime en MEMA como una cuadrícula. Los pozos llenos de PBS proporcionan humedad adicional para evitar el secado de la placa de origen de mezcla de impresión de matriz extracelular.
Imprima los arrays en las placas de ocho pozos, 20 columnas por 35 filas, para un total de 700 puntos. Después de la impresión, guarde las placas en un desecador durante un mínimo de tres días antes de su uso. En primer lugar, diseñar un diseño de placa de 96 pozos con espaciado que permite el uso de una pipeta multicanal con cuatro puntas espaciadas, de modo que el tratamiento de muchas placas MEMA se puede hacer a la vez.
A continuación, recupere los ligandos del congelador, y descongele en hielo en una campana de flujo laminar. Deslice brevemente y gire hacia abajo cada tubo. Utilice el búfer recomendado por el fabricante para diluir los ligandos a un stock de trabajo de 200 veces.
Pipetear 10 microlitros de cada 200 veces ligando en el pozo correspondiente dentro de la placa de 96 pozos. Utilice una película de sellado para sellar las placas y almacenarlas a menos de 20 grados centígrados. Haga placas de tratamiento de ligandos en lotes y capture todos los metadatos para el análisis posterior.
Antes de cultivar las células, bloquee los MEMA con dos mililitros por pozo de búfer de bloqueo no desenfocamiento durante 20 minutos. Utilice un divisor Y con dos pipetas Pasteur para aspirar el tampón de bloqueo en varios pozos a la vez, y luego lave tres veces los pozos con PBS. Para evitar la desicación, deje el volumen final de PBS en los pozos hasta que esté listo para el enchapado celular.
Antes de un experimento MEMA completo, optimice la concentración de siembra de células MCF7 realizando un experimento de valoración celular. Un lugar ideal, como se muestra aquí, tiene suficientes números de celda para extraer datos, pero no tantos que el punto es demasiado confluente. En el MEMA, aspirar las células restantes PBS y MCF7 de semillas a 30.000 a 35.000 células por pozo en dos mililitros de medio de siembra.
Coloque el MEMA en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de la adhesión durante la noche en la incubadora, aspirar el medio y reemplazar con dos mililitros de medio de crecimiento reducido para aislar el impacto estimulante de ligandos específicos. A continuación, descongele una placa de tratamiento de ligando previamente congelada sobre hielo.
Placa descongelada centrífuga a 200 g durante un minuto. Transfiera 200 microlitros de medio de cada pozo en la placa de cultivo MEMA al pozo adecuado en la placa de tratamiento del ligando. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar el ligando con el medio, y transferir esta mezcla de nuevo al pozo apropiado en la placa de cultivo MEMA.
Ligeramente mece a mano y devuelve las placas MEMA a la incubadora para cultivar la combinación ligando-ECM a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Después de 71 horas, añadir 100 veces EdU a los pozos MEMA para una concentración final de 10 micromolares. Incubarlo durante otra hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Después de la incubación final, aspirar los pozos. Fijar MEMA en dos mililitros por pozo de 2%PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, aspirar la PFA de los pozos.
Permeabilizar con dos mililitros por pozo de 0.1%surfactante no iónico durante 15 minutos. Aspirar el surfactante, y luego lavar los pozos con dos mililitros de PBS y PBS-T, secuencialmente. Después de eso, agregue 1,5 mililitros de reactivos de reacción de detección de EdU a cada pozo.
Incubar durante una hora a temperatura ambiente, balanceándose y protegido de la luz. A continuación, apagar la reacción con 1,5 mililitros tampón comercial de enfriamiento por pozo. Aspirar de nuevo y lavar con PBS-T antes de incubar con concentraciones optimizadas de manchas o anticuerpos.
Incubar pozos MEMA con anticuerpos primarios en tampón de tinción, balanceándose a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación primaria de anticuerpos, lave los pozos con PBS seguidos de PBS-T. Añadir anticuerpos secundarios en 0,5 microgramos por mililitro DAPI, diluido en tampón de tinción.
Incubar, balancearse durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Lavar los pozos dos veces con dos mililitros por pozo de PBS, y dejarlos en los dos últimos mililitros de PBS. Para tomar imágenes de MEMA manchado, colóquelo en la etapa del microscopio de un sistema de imágenes automatizado con canales de detección fluorescentes adecuados.
Salida de datos de imagen resultantes en un sistema de gestión de imágenes. Segmente las celdas y calcule los niveles de intensidad mediante CellProfiler. En este protocolo, los perfiles de ciclo celular de los valores de intensidad DAPI binned frente a los recuentos de celdas de una placa de ocho pozos indican las celdas en la fase del ciclo de celda G1 frente a G2.
Esto corresponde a dos contenidos de NDNA en las células en la fase de crecimiento temprano, y cuatro contenido de ADNn en las células a punto de someterse a mitosis. Se muestra el impacto del microambiente de ligandos y ECM tanto en el número de célula como en la incorporación de EdU. El rojo indica un número de celda más alto y el azul es el número de celda inferior.
Muchos de los efectos son impulsados por ligandos, ya que la condición ECM no impactó fuertemente el número de células o la positividad de EdU. Natagen 1 es una clara excepción, ya que la presencia de esta molécula de ECM inhibe la unión celular y el crecimiento de MCF7. Los ligandos como FGF6 y neuregulin-1 alfa mejoran el número de células y tienen altas tasas de incorporación de EdU, mientras que los ligandos como la anfibulina y la neuregulina-1 SMDF inhiben la unión celular y el crecimiento de las células.
Un ejemplo de células MCF7 que crecen en un punto MEMA tratado con neuregulin-1 alfa muestra altas tasas de incorporación de EdU, indicadas por núcleos rosados. En esta imagen, la mancha verde es máscara de celda, y azul es DAPI. Dado que un experimento MEMA completo es costoso, es muy importante realizar pasos de optimización, como valoraciones de células y sueros, antes de realizar el experimento completo.
Una vez que se identifican las condiciones de interés microambiente utilizando la plataforma MEMA, los ligandos específicos y las proteínas de matriz extracelular se pueden estudiar en mayor profundidad utilizando los sistemas tradicionales de cultivo celular 2D y 3D.
