Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

Las estrategias actuales para un cribado de medicamentos de orina son costosas de realizar para el análisis rutinario de paneles cada vez más grandes de drogas de abuso según sea necesario para las pruebas de lugares de trabajo, así como aplicaciones de monitoreo de medicamentos terapéuticos. Además, los métodos basados en ensayos amino son propensos a sesgos y, en última instancia, se limitan al análisis objetivo de paneles de fármacos conocidos. La principal ventaja de nuestro método, que se conoce como MSI-CE-MS, es que permite el cribado rápido de un panel de fármacos ilimitado y sus metabolitos con alta precisión y mínima prueba de la muestra.

Existe una necesidad urgente de un método de detección asequible y de alto rendimiento para mejorar los resultados de los pacientes mediante la confirmación de la adherencia y la optimización de los regímenes de dosificación de drogas, al tiempo que se revela el uso ilícito de drogas. Esta plataforma de separación multiplexada se puede aplicar a una variedad de otras áreas de investigación relacionadas con el perfilado de metabolitos dirigidos o no dirigidos en muestras biológicas complejas. Comience por descongelar muestras de orina matinadas desidentificadas recogidas de pacientes con un historial conocido de medicamentos recetados para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius en hielo y vórtice las muestras descongeladas durante 30 segundos.

A continuación, sedimentar las muestras por centrifugación y combinar tres alícuotas de 10 microlitros de cada muestra con 10 microlitros de normas internas deuteradas, cinco microlitros de 4-fluoro-L-fenilalanina y 3-cloro-L-tyrosina solución y 25 microlitros de agua desionizada. A continuación, centrifugar las mezclas durante un minuto y transferir 20 microlitros de cada muestra a viales de polipropileno individuales. Para ajustar los parámetros de acondicionamiento capilar de sílice fusionada sin recubrimiento, corte un diámetro interior de 135 centímetros de largo, 50 micrómetros y un capilar de 360 micrómetros de diámetro exterior de un carrete.

Utilice un fabricante de ventanas capilares para eliminar unos 7 milímetros de recubrimiento de poliamida de ambos extremos de cada capilar. A continuación, instale las entradas capilares en la electroforesis capilar, o cartucho CE, colocando cada capilar durante dos turnos de 360 grados, teniendo cuidado de sobresalir alrededor de dos milímetros de las salidas capilares de la aguja pulverizadora CE. Cuando se hayan instalado todos los capilares, cargue cuidadosamente el cartucho CE en el sistema CE y almacene el pulverizador CE fuera de la fuente iónica.

Coloque la cromatografía líquida, o pulverizador LC, en la fuente de iones y seleccione el lavado en el software del sistema para configurar el acondicionamiento capilar. Establezca la duración del metanol, un hidróxido de sodio molar, agua desionizada y electrolito de fondo al ras a 30 minutos por descarga y coloque la bomba isocrática en espera durante el período de acondicionamiento capilar. Después del último lavado, limpie el espectrómetro de masas de electroforesis capilar, o pulverizador CE-MS, y el electrodo CE con toallitas empapadas de metanol.

Limpie la interfaz CE-MS con una solución de agua isopropanol de uno a uno para eliminar cualquier depósito de sal residual. Sustituya el pulverizador LC por el pulverizador CE-MS limpio y un capilar recién acondicionado en la interfaz líquida de la vaina coaxial. A continuación, encienda la bomba isocrática y aplique una tensión de 30 kilovoltas durante 15 minutos para asegurarse de que se logra un perfil de corriente CE estable antes del análisis de orina.

En el software del sistema, seleccione el preacondicionamiento, establezca el vaciado en 600 segundos y especifique una posición de archivo de electrolito de fondo. Ajuste la inyección para inyectar hidrodinámicamente las muestras a 100 milibares durante cinco segundos y para inyectar electrocincopios de electrolitos de fondo a 30 kilovoltios durante 75 segundos. Establezca la tensión aplicada en 30 kilovoltas, la temperatura del cartucho a 25 grados centígrados y el tiempo de ejecución total en 40 minutos.

Luego, usando el calendario, aplique un gradiente de presión de dos milibares por minuto de cero a 40 minutos durante la separación. Una vez completada la adquisición de la muestra, enjuague el capilar a 50 milibares de presión con los electrolitos de fondo durante la noche mientras el capilar está en el pulverizador CE en la fuente de iones. Establezca la detección de iones positivos TOF-MS para que abarque una relación masa-carga de 50 a 1.700, con una tasa de adquisición de datos de 500 milisegundos por espectro, y confirme que tanto el perfil como los datos centroide se almacenan en formato de archivo D.

Establezca las condiciones de ionización de la electrospray en voltajes capilares y de boquilla de 2000 voltios cada uno, el gas nebulizador a 10 libras por pulgada cuadrada, y la entrega de gas de secado a ocho litros por minuto a 300 grados Celsius con un flujo de gas de vaina de 3,5 litros por minuto a 195 grados Celsius durante la adquisición. A continuación, establezca los ajustes de voltaje MS del fragmentador, skimmer y octapole una radiofrecuencia en 120, 65 y 750 voltios, respectivamente, y establezca los parámetros de control de instrumentos y adquisición de datos de acuerdo con el diseño del experimento. Para el análisis de datos, abra los datos CE-MS multisegmento en el software del sistema.

En Cromatogramas, establezca los datos de extracción y los formatos de datos espectrales de masa y cromatograma en modo perfil. En suavizado, seleccione Savitzky-Golay cúbico cuadrático y establezca el ancho de la función en 15 puntos. A continuación, haga clic en Integrar MS y establezca el integrador en ágil.

En Filtros de pico, establezca el número máximo de picos en 11. En la vista, haga clic en la lista de picos de integración y seleccione el número máximo, el tiempo de retención, el área de pico, la altura máxima y la relación señal/ruido. A continuación, guarde los parámetros con un nombre de método único y aplique el método al proceso para la interpretación de cada conjunto de datos.

En este análisis representativo de varios fármacos isobáricos isoróricos de abuso y sus metabolitos, se detectaron 30 picos resueltos de 10 muestras independientes de una mezcla de medicamentos sin arrastre de muestras. Otros dos opioides isobáricos podrían resolverse completamente como 20 picos distintos con la adquisición completa de los datos de exploración. Del mismo modo, dos isómeros posicional de anfetamina se resolvieron completamente en este análisis CE-MS multisegmento, para distinguir el abuso ilícito de metanfetaminas del posible mal uso de la fentermina, un estimulante prescrito que se utiliza como un supresor del apetito para bajar de peso.

En este análisis representativo de detección de fármacos, se dedujo un resultado positivo de la prueba de detección de metadona por la detección de un pico de señal grande que coexistió con el pico de metadona-d3 con un error de masa baja. No se detectaron otras señales en ninguna otra muestra de orina dentro de la misma carrera y la concentración de metadona detectada superó 13 veces el límite de corte recomendado en comparación con su relación de respuesta iónica medida en la muestra y corregida por un factor de dilución de orina de cuatro veces, lo que confirma la adherencia de los pacientes a la terapia de mantenimiento de metadona. Aquí, una configuración de inyección en serie en CE-MS multisegmento, que comprende cinco calibradores de drogas diferentes, se analizó por duplicado dentro de una sola ejecución junto con la orina sintética en blanco.

Los metabolitos de la droga fueron detectados como sus iones moleculares macañidos por encima de sus límites de corte de cribado. Después de este procedimiento, un gran número de metabolitos polares e iónicos en la orina también pueden ser analizados por MSI CMS en apoyo de la investigación metabólica basada en el descubrimiento. Además, se puede lograr una vigilancia integral de una amplia gama de medicamentos exógenos y sus metabolitos, incluidos los medicamentos no recetados y las drogas ilícitas propensas al abuso.

Este método optimizado también se puede utilizar para examinar rutinariamente otras drogas de abuso. Estos podrían ser metabolitos de cannabis o alcohol y nuestro método también puede diferenciar entre una matriz de orina sintética o falsa y una muestra de orina natural, real, auténticamente donada también. Recuerde tener siempre cuidado al trabajar con fluidos biológicos.