Este protocolo permite a los investigadores monitorear la supervivencia en una sola célula e identificar variables que predicen significativamente la muerte o supervivencia celular. Los ensayos convencionales de citotoxicidad evalúan las poblaciones de células y carecen de la capacidad de discriminar las células individuales. La microscopía longitudinal permite la asignación del tiempo de muerte para cada célula en una población.
Esta técnica es adecuada para evaluar nuevas terapias para enfermedades neurodegenerativas y otras condiciones. Este método ha demostrado ser invaluable para explorar los mecanismos de la enfermedad en condiciones neurodegenerativas, y podría aplicarse con la misma eficacia hacia otros trastornos en los que la muerte celular es de interés. Los investigadores pueden tener problemas para lograr eficiencias de transfección adecuadas sin toxicidad indebida.
La práctica con la pipeta multicanal y la familiaridad con el protocolo deben disminuir estas dificultades con el tiempo. La microscopía es una metodología inherentemente visual. Por lo tanto, la técnica puede ser más fácil de entender observando además de la lectura.
Para comenzar, combine la cantidad adecuada de medios séricos reducidos y reactivo de transfección en un tubo, y reducir los medios séricos y el ADN en un tubo separado. Incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, combine el contenido de ambos tubos e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Utilice una pipeta multicanal y vaguadoras de plástico esterilizado para lavar las neuronas corticales dos veces con 100 microlitros de medios basales neuronales por pozo. Y almacene los medios acondicionados y otros medios restantes a 37 grados centígrados. Sustituya el NBM por 100 microlitros de la solución NBKY previamente preparada por pozo.
Después de 20 minutos, pipetear 50 microlitros del reactivo de transfección y la mezcla de ADN gota a gota en cada pocólite. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Enjuague las células dos veces con la solución NBKY.
A continuación, agregue 100 microlitros de medios acondicionados y 100 microlitros de la solución NBC a los pozos. Para comenzar a tomar imágenes de las células, coloque la placa de 96 pozos en un microscopio fluorescente. Utilice una marca fiduciaria única para cada placa como referencia para la alineación futura y guarde una imagen para futuras referencias.
A continuación, vaya a las áreas de interés y registre sus coordenadas x e y en relación con la marca. Utilice una marca fiduciaria única para cada placa como referencia para la alineación futura y guarde una imagen para futuras referencias. Por último, concéntrese en las células trans infectadas que expresan una etiqueta fluorescente.
Tome varias imágenes a intervalos espaciados regularmente en los canales fluorescentes apropiados. Para comenzar con el procesamiento de imágenes, haga doble clic en el icono de Fiji. A continuación, haga clic y arrastre la macro de procesamiento de subrayado de la imagen a la barra de Fiji para abrir la macro dentro de Fiji.
Ajuste las líneas dos a siete de la macro de procesamiento de subrayado de la imagen de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, haga clic en la costura y, a continuación, en la costura de rejilla/colección. Ajuste los ajustes dentro de los menús desplegables, escriba y orden, hasta que se produzca una imagen cosida con precisión.
Ajuste el tipo de rejilla y las variables de orden de puntada en las líneas ocho y nueve de acuerdo con estas selecciones. A continuación, ajuste la línea 10 para especificar el número de imágenes por pozo y establezca la opción de resta de fondo en la línea 14 en true, si es necesario. Ajuste la línea 15 para establecer el radio de la bola rodante de acuerdo con el protocolo de texto y haga clic en Ejecutar.
Por último, abra las pilas de imágenes de salida e identifique manualmente las neuronas muertas de acuerdo con el protocolo de texto. Registre los datos en un archivo de hoja de cálculo. Para realizar análisis estadísticos, haga doble clic en el icono para la supervivencia.
Guión R. Resalte la línea dos y haga clic en el botón Ejecutar para cargar la biblioteca de supervivencia. A continuación, cambie la ruta en la línea cinco para llamar a la hoja de cálculo de entrada y haga clic en el botón Ejecutar.
Resalte las líneas ocho y nueve y haga clic en el botón Ejecutar para realizar el análisis de peligros proporcionales de Cox. Resalte las líneas 12 a 16 y 19 a 24. Haga clic en el botón Ejecutar para trazar el riesgo acumulado de muerte y los datos de supervivencia como una curva Kaplan-Meier.
En este estudio, las neuronas corticales de rata fueron transfectados a los cuatro días después del enchapado con un plásmido que codifica la proteína fluorescente M manzana. 24 horas después de la transfección, las neuronas fueron imágenes por microscopía de fluorescencia cada 24 horas durante 10 días consecutivos. Después de la adquisición de la imagen, las imágenes fueron procesadas y examinadas secuencialmente para marcar la muerte celular.
La hora de muerte de cada célula fue determinada por cambios en la fluorescencia, morfología y fragmentación del cuerpo celular. El análisis proporcional de riesgos de Cox realizado en los datos de supervivencia de las neuronas mutantes dio lugar a una relación de peligro de 2,2. Este resultado indica una tasa más rápida de muerte en las neuronas mutantes en comparación con la población de tipo salvaje.
Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es pipetear cuidadosamente. Minimizar la exposición al aire y evitar las burbujas es fundamental para una transfección exitosa. Después de la transfección, la microscopía longitudinal de fluorescencia se puede utilizar para rastrear varios factores que pueden contribuir a la muerte celular, incluyendo la localización de proteínas, la rotación y el nivel de expresión, además de la supervivencia celular.
Dentro del campo de la neuro degeneración, la naturaleza dinámica de la microscopía longitudinal ha arrojado luz sobre si la agregación de proteínas asociadas a la enfermedad representa un evento tóxico o protector. Ninguno de estos reactivos o instrumentos son peligrosos.
