Nuestro protocolo permite la toma de imágenes de todo el cerebro mosca durante el comportamiento, que es importante para entender cómo las neuronas en diferentes áreas cerebrales interactúan para dar forma al comportamiento. A diferencia de otros protocolos publicados, esto fue desarrollado específicamente para acceder a todo el cerebro mientras la mosca se comporta y se sintiendo por un olor, sabor o estimulación visual. Para crear una ranura para cabeza.
Después de imprimir el soporte con una impresora 3D, coloque una pieza de cinta adhesiva rectangularmente sobre una superficie plana bajo un microscopio estéreo. Y cortar una pieza de aproximadamente cinco milímetros por un centímetro. Utilice dos bisturíes fijados juntos en paralelo para cortar una ranura siguiente de 400 por 400 micrómetros en el centro del lado más largo de la cinta, y coloque la cinta sobre el lado más plano del agujero en la parte inferior del soporte.
Utilice fórceps para empujar la cinta aproximadamente 500 micrómetros alrededor del agujero. Y usa esmalte de uñas negro para cubrir la parte superior de la cinta y el soporte. Después de dejar que el esmalte de uñas se seque durante al menos una hora, utilice un tejido enrollado para agregar aproximadamente un microlitro de grasa a la ranura de la cabeza.
Para preparar la ranura del cuerpo, corte un trozo de cinta de aproximadamente dos centímetros de ancho en dos pedazos y corte rodajas de 1,5 milímetros de ancho. A continuación, corte un hombro de 0,3 milímetros de profundidad y ranura para el cuerpo y asegúrese de que la cinta se ajuste al soporte. Para fijar una mosca en el soporte, coloque primero un recipiente poco profundo con hielo debajo del microscopio diseccionador y coloque el soporte boca abajo en un pedazo de tejido de laboratorio colocado sobre el hielo.
Aspirar una mosca de la fruta hembra de uno a cuatro días de edad de su vil, y volar a hielo sin fundir. Cuando la mosca deja de moverse, utilice fórceps Dell para agarrar la mosca en la base de las alas y deslice la mosca hacia el soporte con el cuello dentro de la ranura. Los ojos deben colocarse por igual a ambos lados de la ranura.
Si es necesario, agregue un microlitro de grasa a la parte superior de la cabeza para evitar que el pegamento llegue a la parte posterior de la cabeza. A continuación, cubra el cuerpo con un pañuelo y un poco de hielo para asegurarse de que la mosca no se mueva. Para fijar la cabeza, colóquela en un ángulo aproximado de 20 grados desde una vista totalmente posterior.
Y utilice un tejido enrollado para aplicar pegamento UV alrededor de la cabeza mientras evita ensuciar el área sensorial de interés. Para experimentos de sabor, utilice fórceps para extraer el proboscis y añadir pegamento en la base de proboscis para evitar el movimiento. Si no se planifica ningún experimento de sabor empuje y pega el proboscis en la cabeza.
Cura el pegamento con luz UV durante cinco segundos, y usa un tejido enrollado para limpiar cuidadosamente las áreas que rodean la cabeza, para eliminar cualquier pegamento líquido restante que pueda pegarse a las piernas y puertas del suelo, áreas sensoriales. A continuación, utilice una tira delgada de cinta adhesiva o un tejido para mover las piernas hacia la parte delantera según sea necesario. Para colocar el cuerpo, retire el recipiente de hielo y dé la vuelta al soporte.
Retire el agua alrededor de la mosca y actuando rápidamente antes de que la mosca se recupere de la anestesia coloque la cinta de ranura del cuerpo sobre el agujero y empuje suavemente el cuerpo de la mosca hacia abajo, teniendo cuidado de no estirar demasiado el cuello. Cubra los agujeros grandes restantes con cinta adhesiva y agregue aproximadamente un microlitro de grasa a la parte posterior de la cabeza, para evitar que el pegamento se pegue en ese lugar. Utilice un tejido enrollado para pintar pegamento UV alrededor del tórax y en la parte superior de la cinta y el tórax, y cure el pegamento con luz UV durante aproximadamente cinco segundos.
Retire cuidadosamente cualquier grasa y pegamento sin seguridad con un tejido de laboratorio y agregue aproximadamente un mililitro de solución salina a la parte superior de la cabeza. Utilice fórceps para hacer a un lado cualquier burbuja de aire y compruebe si hay fugas colocando un deslizamiento de cubierta sobre la solución salina y girando el soporte para comprobar si hay solución salina en el lado frontal. Si se observa solución salina, retire la solución salina y fije el orificio con más pegamento o más grasa.
Para diseccionar la cabeza seleccione la ampliación más alta y utilice fórceps afilados muy finos para hacer dos cortes en la base del triángulo central de la cutícula oscura a cada lado del cuello. Corte alrededor del triángulo oscuro y retire esta parte de la cutícula. Músculo 16 y el esófago deben ser visibles a través de este agujero y moverse rítmicamente.
Utilice los fórceps muy finos para pellizcar cuidadosamente la parte superior de esta área para cortar el músculo 16 sin perforar el esófago. Si el movimiento rítmico detiene el músculo 16 probablemente se eliminó. Cuando el músculo ha sido exqueado a partir del borde medial de la región del triángulo oscuro, utilice los fórceps como un par de tijeras para cortar cuidadosamente y eliminar la cutícula restante en trozos pequeños.
A continuación, utilice los fórceps para agarrar y retirar lenta y constantemente un saco de aire a la vez. En este video se expresó una sonda de calcio en todas las neuronas de estos dos cerebros de mosca de la fruta. Y se presentó un soplo de olor.
En este experimento, la expresión del sensor de calcio se restringió a las neuronas dopaminérgicas y serotonérgicas. Observe la estrecha correlación entre la fuerte actividad sincrónica sobre el cerebro y el comportamiento de las moscas caminando que ilustra cómo se puede observar todo el cerebro durante un comportamiento específico. Mediante el análisis de componentes de principio y el análisis independiente de componentes se pueden extraer diferentes regiones funcionales resaltadas en diferentes colores.
La forma y localización de las regiones funcionales permite asignar las regiones a plantillas anatómicas. Identificar regiones cerebrales y, en algunos casos, tipos de neuronas. Una vez alineados con la plantilla anatómica adecuada, los valores de fluorescencia se pueden promediar dentro de regiones cerebrales anatómicas específicas para el análisis cuantitativo.
Por ejemplo, en este análisis podemos observar que todas las regiones son más activas durante el caminar que durante el aseo. Ten paciencia. Aprender esta técnica de disección cardíaca es difícil.
En mi laboratorio, las personas necesitan en promedio de tres a cuatro meses antes de dominarlo y obtener sus primeras preparaciones útiles. Siguiendo este protocolo podemos registrar la actividad cerebral a gran escala usando un microscopio de fluorescencia. Se indican particularmente métodos rápidos como la microscopía de campo ligero.
