Los vectores virales pueden introducir material genético en las células para compensar los genes defectuosos, para regular las proteínas de crecimiento importantes o para fabricar marcadores que puedan rastrear circuitos neuronales. Introducir vectores virales en el sistema nervioso es un desafío debido a las barreras biológicas innatas. La inyección directa en el tejido de la médula espinal evita estas barreras, lo que permite el acceso a cuerpos celulares o sinapsis.
Apuntar correctamente a los niveles de L1 a L4 espinal puede ser difícil. Es importante utilizar puntos de referencia para verificar el objetivo y recordar que estos segmentos se alinean a las vértebras T11 a T13. El día del procedimiento, conecte el inyector en la microbobo bomba y coloque la microbobo bomba en un micromaniprógrafo con una escala vernier.
Utilice una jeringa con una aguja flexible para cargar cuidadosamente un tinte de color en una de las agujas de vidrio e inserte la aguja de vidrio en el inyector. A continuación, confirme que la aguja se siembra correctamente en las arandelas, y que la tapa del inyector está atornillada apretada, y que la aguja del inyector de acero se extiende aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la aguja de vidrio. Antes de comenzar el procedimiento, descongele al menos un microlitro, más un pequeño volumen de virus adicional por inyección del almacenamiento del congelador, y confirme la falta de respuesta de la pellizca del dedo del pie en una rata anestesiada.
Afeitarse a lo largo de la línea media dorsal desde las caderas hasta el ángulo inferior de las escápulas del animal, tirando de la piel tensa para un afeitado más fácil y preciso, y desinfectar la piel expuesta con 5% de yodo secuencial y 70%exfoliantes de etanol. Aplique pomada oftálmica en ambos ojos. Luego coloque el animal en un paño estéril y coloque la gasa debajo de la vejiga para recoger cualquier orina.
Para identificar el sitio de la incisión de la piel, presione los dedos suavemente en la última costilla para localizar la vértebra L1. Usando esta vértebra como un punto de referencia y sosteniendo la piel tensa por suave propagación mientras presiona firmemente con el bisturí, utilice una cuchilla quirúrgica número 10 para hacer una incisión de piel de tres a cuatro centímetros terminando sólo inferior a L1 para exponer el músculo. Utilice fórceps y tijeras para sentir los procesos espinosos.
Haga pequeños cortes rostrales para dejar espacio para agarrar de forma segura en un proceso superior con fórceps de dientes de rata. Y hacer dos cortes largos y profundos lo más cerca posible de los procesos. Después de asegurar los músculos laterales en su lugar, limpiar el músculo alrededor de los procesos para determinar la forma de sus cabezas.
A continuación, visualice las formas de las cabezas de los procesos espinosos para identificar el sitio de laminectomía. El T11 y los procesos T12 y T13 que se unen serán el lugar de la laminectomía. Una vez que el área objetivo ha sido identificada correctamente, esparza suavemente las vértebras para revelar los ligamentos intervertebrales, y usa rongeurs para tomar pequeñas picaduras de los procesos espinosos y el aspecto dorsal de las vértebras.
Limpie el hueso lejos de la línea media para que se pueda observar el vaso sanguíneo de línea media, dejando una ventana que revela claramente el tejido de la médula espinal y está libre de desechos. A continuación, apriete los fórceps estabilizadores a los procesos espinosos rostrales y caudal a la ventana de laminectomía para asegurar al animal en un soporte espinal. Y elevar el abdomen del animal para negar el efecto de los movimientos respiratorios.
Para cargar el virus en el inyector, pipetee aproximadamente cinco microlitros de la acción descongelada en un pedazo de Parafilm, y coloque las agujas de vidrio de modo que la punta esté dentro de la gota. Utilice la microbobo bomba para retirar hasta cuatro microlitros de virus a una velocidad de 20 a 100 nanolitros por segundo, y configure el controlador para que se inyecte antes de liberar una pequeña cantidad de virus de la punta de la aguja para asegurarse de que no está bloqueado. Limpie cualquier exceso de virus con una toallita de laboratorio y coloque los micromanipuladores para que la escala vernier sea visible.
Coloque la aguja en la línea media de la médula espinal y utilice la escala vernier en el micromaniprógrafo para dirigir la aguja lateralmente 0,8 milímetros. A continuación, baje la aguja a la cuerda espinal hasta que esté sangrando, pero no punturando, la dura, y utilice un movimiento de torsión rápida para perforar la dura con la aguja hasta que la punta de la aguja se haya hundido a una profundidad de 1,5 milímetros. Una vez que la aguja está en su lugar, programe el inyector para entregar el virus a una velocidad de 400 nanolitros por minuto, y confirme que el virus está entrando en el acorde espinal observando el progreso del frente del tinte.
Una vez finalizada la inyección, deje reposar la aguja en la médula espinal durante dos a cinco minutos para facilitar la difusión del virus, antes de retirar lentamente la aguja para su colocación en el siguiente lugar de inyección. Después de la última inyección, retire el animal del soporte de la columna vertebral para permitir la eliminación de cualquier dispositivo utilizado para extender el músculo lateral. A continuación, cierre el músculo con una sutura de catgut cromático 4.0 y grapa la piel con clips de herida de nueve milímetros.
Cuatro semanas después de una inyección exitosa, se observa una expresión significativa de la GFP en las neuronas dentro de la materia gris de la médula espinal torácica en el lado, ipsilateral a la inyección. En la materia blanca, la expresión de GFP se observa en los axones en el cordón ipsilateral, especialmente en áreas típicas de los axones propriospinales. Un aumento más alto de las neuronas de materia gris revela un ejemplo de una expresión de señal típica en cuerpos celulares neuronales y dendritas.
La expresión de GFP en las neuronas también se puede observar en núcleos de tronco encefálica, como dentro de la formación reticular pontina. Los factores clave para un procedimiento exitoso de inyección de la médula espinal son la orientación vertebral correcta y asegurarse de que el virus está entrando en el tejido Si se realiza una lesión de la médula espinal rostral antes de este procedimiento, se puede utilizar la inyección directa para rastrear las neuronas que restablecen las conexiones alrededor de la lesión.
