病毒载体可以将遗传物质引入细胞,以补偿有缺陷的基因,提高重要的生长蛋白,或制造可以追踪神经回路的标记物。由于与生俱来的生物学障碍,将病毒载体引入神经系统是具有挑战性的。直接注射到脊髓组织中绕过这些屏障,允许进入细胞体或突触。
正确定位 L1 到 L4 脊髓水平可能很困难。使用地标来验证目标并记住这些段线到 T11 到 T13 椎骨非常重要。在手术当天,将喷油器插入微泵,然后将微泵放入具有更薄度的微操纵器中。
使用带柔性针头的注射器小心地将彩色染料装入其中一个玻璃针中,并将玻璃针插入喷油器中。然后确认针头已正确播种到垫圈中,喷油器盖拧紧,并且钢喷油器针头的延伸距离约为玻璃针长度的四分之三。在开始手术之前,解冻至少一微升,加上从冷冻室注射少量额外病毒,并确认麻醉大鼠的针头趾缺乏反应。
沿着后侧中线从臀部剃到动物肩骨的劣质角度,拉紧皮肤,进行更轻松、更精确的剃须,并连续用 5% 碘和 70% 乙醇磨砂对裸露的皮肤进行消毒。将眼科软膏涂抹在两只眼睛上。然后将动物放在无菌布上,将纱布放在膀胱下方以收集尿液。
要识别皮肤切口的部位,请轻轻按压最后一根肋骨的手指以定位 L1 椎骨。使用这个椎骨作为一个里程碑,并举行皮肤紧绷的轻轻蔓延,同时用手术刀用力按,使用数字10手术刀片,使三到四厘米的皮肤切口结束只是低于L1暴露肌肉。使用钳子和剪刀来感受旋转过程。
做小的滚切,让空间牢牢地抓住与大鼠牙钳的上部过程。并尽可能接近流程,进行两次长而深的切割。固定横向肌肉到位后,清除周围的肌肉,以确定其头部的形状。
然后可视化旋转过程头部的形状,以识别拉明切除术位点。T11 和连接 T12 和 T13 过程将是拉明切除术的站点。一旦目标区域被正确识别,轻轻展开椎骨以露出椎间韧带,并使用旋颈小咬椎的旋转过程和椎背的侧部。
清除中线外骨骼,以便观察中线血管,留下一个窗口,清楚地显示脊髓组织,并且没有碎屑。然后将稳定钳紧到旋转过程,将胸腺和胸膜固定到拉明切除术窗口,将动物固定在脊柱架中。提高动物的腹部,以抵消呼吸运动的影响。
要将病毒加载到喷油器中,将解冻库存的大约五微升移液器插入一块 Parafilm 上,并放置玻璃针,使尖端位于液滴内。使用微泵以 20 到 100 纳米升/秒的速度提取多达 4 微升的病毒,并设置控制器注射,然后从针尖释放少量病毒,以确保病毒不会被阻塞。用实验室擦拭清除任何多余的病毒,并放置微操纵器,使可见比额。
将针头放在脊髓的中线,并使用微操纵器上的测光量表横向引导针头 0.8 毫米。然后将针头降到脊柱和弦,直到它缩进,但不是穿刺,杜拉,并使用快速扭曲运动刺穿杜拉与针,直到针尖已下降到1.5毫米的深度。一旦针头就位,编程喷油器以每分钟400纳米光的速度传递病毒,并通过观察染料前部的进度来确认病毒正在进入脊髓和弦。
注射完成后,让针头在脊髓中休息两到五分钟,以方便病毒的传播,然后慢慢提取针头,以便定位到下一个注射部位。最后一次注射后,将动物从脊柱架上取出,以便取出用于传播横向肌肉的任何装置。然后用 4 . 0 缝合线关闭肌肉,用 9 毫米伤口夹固定皮肤。
成功注射四周后,在侧胸脊髓的灰质内的神经元中观察到显著的GP表达,对注射进行刺激。在白质中,在轴线中的轴子中观察到GSP表达,特别是在自体轴体的典型区域。灰质神经元的放大率越高,就会发现神经元体和树突中典型信号表达的例子。
神经元中的GP表达也可以在脑干核中观察到,例如在浮核内柱形成。成功脊髓注射程序的关键因素是正确的椎骨靶向,并确保病毒进入组织如果在手术前进行肩骨脊髓损伤,直接注射可用于追踪在损伤周围重新建立连接的神经元。