Vetores virais podem introduzir material genético nas células para compensar genes defeituosos, para regular proteínas importantes de crescimento, ou para fabricar marcadores que possam rastrear circuitos neurais. Introduzir vetores virais no sistema nervoso é um desafio devido a barreiras biológicas inatas. A injeção direta no tecido medular contorna essas barreiras, permitindo o acesso a corpos celulares ou sinapses.
Mirar corretamente os níveis de coluna L1 a L4 pode ser difícil. É importante usar pontos de referência para verificar o alvo e lembrar que esses segmentos se alinham às vértebras T11 a T13. No dia do procedimento, conecte o injetor na microbomba e coloque a microbomba em um micromanipulador com uma escala vernier.
Use uma seringa com uma agulha flexível para carregar cuidadosamente um corante colorido em uma das agulhas de vidro e inserir a agulha de vidro no injetor. Em seguida, confirme que a agulha está semeada corretamente nas arruelas, e que a tampa do injetor está aparafusada em apertado, e que a agulha do injetor de aço é estendida aproximadamente três quartos do comprimento da agulha de vidro. Antes de iniciar o procedimento, descongele pelo menos um microliter, além de um pequeno volume de vírus extra por injeção do armazenamento do congelador, e confirme a falta de resposta de beliscão do dedo do pé em um rato anestesiado.
Raspe ao longo da linha dorsal dos quadris até o ângulo inferior da escápula do animal, puxando a pele esticada para uma barba mais fácil e precisa, e desinfetar a pele exposta com esfogem sequenciais 5% de iodo e 70% de etanol. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos. Em seguida, coloque o animal em um pano estéril e coloque gaze debaixo da bexiga para coletar qualquer urina.
Para identificar o local da incisão da pele, pressione os dedos suavemente na última costela para localizar a vértebra L1. Usando esta vértebra como um marco e segurando a pele esticada por uma leve propagação enquanto pressiona firmemente com o bisturi, use uma lâmina cirúrgica número 10 para fazer uma incisão esfolada de três a quatro centímetros terminando apenas inferior à L1 para expor o músculo. Use fórceps e tesouras para sentir os processos espinhosos.
Faça pequenos cortes rostrais para permitir que o espaço agarre com segurança em um processo superior com fórceps de dentes de rato. E fazer dois cortes longos e profundos o mais próximo possível dos processos. Depois de fixar os músculos laterais no lugar, limpe o músculo ao redor dos processos para determinar a forma de suas cabeças.
Em seguida, visualize as formas das cabeças dos processos espinhosos, a fim de identificar o local da laminectomia. Os processos T11 e T12 de junção serão o local da laminectomia. Uma vez que a área alvo tenha sido corretamente identificada, espalhe suavemente as vértebras para revelar os ligamentos intervertebrales, e use rongeurs para tomar pequenas mordidas dos processos espinhosos e do aspecto dorsal das vértebras.
Limpe o osso da linha média para que o vaso sanguíneo da linha média possa ser observado, deixando uma janela que revela claramente o tecido medular e está livre de detritos. Em seguida, aperte as fórceps estabilizadores aos processos espinhosos rostral e caudal à janela laminectomia para fixar o animal em um suporte espinhal. E levantar o abdômen do animal para negar o efeito dos movimentos respiratórios.
Para carregar o vírus no injetor, pipeta aproximadamente cinco microliters do estoque descongelado em um pedaço de Parafilm, e posicione as agulhas de vidro para que a ponta esteja dentro da gota. Use a micro-bomba para retirar até quatro microliters de vírus a uma taxa de 20 a 100 nanoliters por segundo, e defina o controlador para injetar antes de liberar uma pequena quantidade de vírus da ponta da agulha para garantir que ele não seja bloqueado. Limpe qualquer vírus em excesso com uma limpeza de laboratório e posicione os micromanipuladores para que a escala vernier seja visível.
Coloque a agulha na linha média da medula espinhal, e use a escala vernier no micromanipulador para direcionar a agulha lateralmente 0,8 milímetros. Em seguida, abaixe a agulha para a corda espinhal até que esteja recuando, mas não perfurando, a dura, e use um movimento de torção rápida para perfurar a dura dura com a agulha até que a ponta da agulha tenha afundado a uma profundidade de 1,5 milímetros. Uma vez que a agulha esteja no lugar, programe o injetor para entregar o vírus a uma taxa de 400 nanoliters por minuto, e confirme que o vírus está entrando na corda espinhal observando o progresso da frente de corante.
Uma vez que a injeção esteja concluída, deixe a agulha descansar na medula espinhal por dois a cinco minutos para facilitar a difusão do vírus, antes de retirar lentamente a agulha para posicionamento no próximo local de injeção. Após a última injeção, remova o animal do suporte da coluna vertebral para permitir a remoção de quaisquer dispositivos utilizados para espalhar o músculo lateral. Em seguida, feche o músculo com uma sutura de 4,0 cromica de catgut e grampeie a pele com clipes de ferida de nove milímetros.
Quatro semanas após uma injeção bem sucedida, uma expressão de GFP significativa é observada nos neurônios dentro da matéria cinzenta da medula espinhal torácica ao lado, ipsilateral à injeção. Na matéria branca, a expressão GFP é observada nos axônios no cordão ipsilateral, especialmente em áreas típicas dos axônios propriospinais. Uma ampliação mais elevada dos neurônios de matéria cinzenta revela um exemplo de uma expressão típica de sinal em corpos de células neuronais e dendritos.
A expressão GFP nos neurônios também pode ser observada em núcleos do tronco cerebral, como dentro da formação reticular pontina. Os principais fatores para um procedimento bem sucedido de injeção da medula espinhal são o direcionamento vertebral correto e garantir que o vírus esteja entrando no tecido Se uma lesão na medula espinhal rostral for realizada antes deste procedimento, a injeção direta pode ser usada para rastrear neurônios que restabelecem conexões ao redor da lesão.
