Micro CT no se ha aplicado ampliamente a los invertebrados marinos debido a su diversidad en morfología. Nuestro método permite un fácil montaje de muestras en cualquier ángulo adecuado para su morfología. Se puede realizar con materiales comunes, como agua, arcilla y tubos, y si corresponde, a muestras con una variedad de formas, desde un gusano largo hasta una bola redonda.
Demostrando el procedimiento estará Akiteru Maeno, técnico del Instituto Nacional de Genética de Japón. Para empezar, preparar el 0,5% de la agarosa disolviendo 500 miligramos de agarosa en 100 mililitros de agua destilada en un matraz cónico de 250 mililitros, y colocar el matraz en un microondas a la potencia de 800 vatios para calentar alrededor de uno a tres minutos. Enfríe el matraz a temperatura ambiente.
Para montar muestras grandes que no caben en una punta azul de micropipeta de 1000 microlitros, como A.equina, coloque primero la muestra manchada en un plato de 60 milímetros con agua destilada para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie. En un tubo de 50 mililitros, vierta suavemente cinco mililitros de 0,5% de agarosa sin hacer burbujas. Coloque el tubo sobre hielo para endurecer la agarosa.
Luego agregue 20 mililitros de 0.5% de agarosa al tubo, colóquelo sobre hielo hasta que la agarosa comience a endurecerse, y use fórceps para colocar el espécimen dentro de la agarosa. Ajuste la posición de la muestra para que su eje corporal sea vertical. Endurecer la agarosa sobre hielo.
Coloque arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque el tubo de 50 mililitros en la arcilla. Para montar muestras pequeñas que caben en una punta azul de micropipeta de 1000 microlitros, como Harmothoe sp. y X.japonica, decantar la muestra manchada en un plato de 60 milímetros sin usar fórceps.
Con pinzas de anillo, transfiera suavemente las muestras a otro plato de 60 milímetros lleno de agua destilada para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie. A continuación, extraiga 100 microlitros de 0,5% de agarosa en una punta azul de micropipeta de 1000 microlitros y colóquela sobre hielo para endurecerla. Al manipular Harmothoe sp.
añadir 1000 microlitros de 0,5% de agarosa en el enchufe de agarosa en la punta. Utilice pinzas de anillo para transferir suavemente Harmothoe sp. de la placa de 60 milímetros a la solución de agarosa en la punta.
Con una aguja petiolada o pinzas de precisión, ajuste la posición y la orientación de la sp. de Harmothoe para que las chaetae no se doblen de forma antinatural. Asegúrese de que no haya burbujas presentes, y luego coloque la punta sobre hielo para endurecer la agarosa.
Cuando manipule muestras frágiles como X.japonica, utilice una micropipeta para añadir 1000 microlitros de agua destilada en la punta azul con el tapón de agarosa endurecida. Coloque el X.Japonica en el agua destilada para que sea estable entre las paredes de la punta. Para muestras más pequeñas, se puede utilizar una punta amarilla de micropipeta de 200 microlitrotro.
En este caso, utilice 30 microlitros de agarosa para el enchufe, y agregue 200 microlitros de agua ágaosa o destilada. A continuación, corta la punta de una nueva punta azul de micropipeta de 1000 microlitrotro e inserta la punta de la punta enchufada en la nueva punta. Coloque arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque las puntas con la muestra dentro en la arcilla.
Inmediatamente después de montar las muestras, encienda el haz de rayos X a 80 kilovoltas y 100 microamperios. Mientras observa la imagen de transmisión de rayos X, mueva el escenario para que toda la muestra se pueda ver haciendo clic en los botones del eje X y Z, y ajustando manualmente la perilla del eje Y en la etapa de montaje. Ajuste las condiciones de contraste de la imagen para que se puedan observar las estructuras internas.
Ajuste la orientación de la muestra cambiando el ángulo del tubo en la arcilla. Gire la etapa 90 grados estableciendo el eje de rotación en 90 y haciendo clic en el botón Movimiento relativo. Realiza la misma maniobra cuatro veces para completar una rotación completa.
Apague manualmente el haz de rayos X cada vez que se abra la puerta de muestra, a menos que el sistema la apague automáticamente. Ahora haga clic en el botón del eje z y ajuste manualmente el mando del eje Y para mover la etapa de montaje de modo que la muestra esté en el centro de la vista. Gire el escenario 90 grados y ajuste la muestra al centro de nuevo.
Gire la etapa 90 grados tres veces más y ajuste según sea necesario para asegurarse de que la muestra está en el centro de la vista desde todas las direcciones. A continuación, haga clic en el botón del eje X para mover el escenario a lo largo del eje X hacia la fuente del haz de rayos X para ampliar la muestra y ajustar según sea necesario para que solo se ajuste a la vista. Gire el escenario y ajuste según sea necesario para asegurarse de que la muestra se ajusta a la vista desde todas las direcciones.
Ajuste las condiciones de escaneado y, a continuación, comience a escanear. En este experimento, se realizaron imágenes microCT en Actinia equina, Harmothoe sp. y Xenoturbella japonica después de la tinción con la solución de 25%Lugol.
La tinción mejoró con éxito el contraste de las estructuras internas en todos los especímenes, permitiendo observaciones de tejidos blandos internos. Este método es aplicable a especímenes frágiles incluso con daños externos, como se puede ver en la muestra X.japonica con epidermis muy dañada. Se reconstruyó un único conjunto de datos de alta resolución de un espécimen completo para Harmothoe sp.
y X.japonica a partir de múltiples escaneos realizados en diferentes partes pero superpuestas de la muestra. Asegúrese de colocar la muestra en el tubo o la punta y monte el tubo o la punta en el microCT para que no se mueva durante el escaneo. Los datos obtenidos de este procedimiento se pueden utilizar para reconstrucciones de imágenes tridimensionales, lo que permite al investigador comprender completamente la morfología interna y externa de la muestra.
Todos los sistemas microCT utilizan rayos X, pero los detalles pueden ser diferentes de un sistema a otro, así que asegúrese de seguir de cerca las instrucciones de cada sistema.
