מיקרו CT לא הוחל באופן נרחב על חסרי חוליות ימיים בשל המגוון שלהם במורפולוגיה. השיטה שלנו מאפשרת הרכבה קלה של דגימות בכל זווית שמתאימה למורפולוגיה שלה. זה יכול להתבצע עם חומרים נפוצים, כגון מים, חימר, צינורות, ואם ישים, דגימות עם מגוון רחב של צורות, מתולעת ארוכה לכדור עגול.
הדגמת ההליך תהיה אקיטרו Maeno, טכנאי במכון הלאומי לגנטיקה, יפן. כדי להתחיל, להכין 0.5% agarose על ידי המסת 500 מיליגרם של אגרוז ב 100 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק חרוט 250 מיליליטר, ול מניחים את הבקבוק במיקרוגל בכח של 800 וואט כדי לחמם כ 1 עד 3 דקות. מקררים את הבקבוק בטמפרטורת החדר.
כדי להרכיב דגימות גדולות שאינן מתאימות לקצה כחול מיקרופיפיט 1000 מיקרוליטר, כגון A.equina, במקום הראשון את המדגם המוכתם בצלחת 60 מ"מ עם מים מזוקקים לשטוף את פתרון כתמים מוגזם מפני השטח. בצינור של 50 מיליליטר, יוצקים בעדינות חמישה מיליליטר של 0.5% מבלי לייצר בועות. מניחים את הצינור על הקרח כדי להקשיח את ההתעוררות.
לאחר מכן הוסיפו 20 מיליליטר של 0.5% לצינור, מניחים על הקרח עד שהאגוז מתחיל להתקשות, ולהשתמש במדפים כדי למקם את הדגימה בתוך ההתעוררות. התאם את מיקום הדגימה כך שציר הגוף שלה יהיה אנכי. להקשיח את ההתעוררות על קרח.
מניחים חימר על שלב ההרכבה microCT ולהגדיר את הצינור 50 מיליליטר על החימר. כדי להרכיב דגימות קטנות המתאימות לקצה כחול מיקרופיגט 1000 מיקרוליטר, כגון הרמות'ו sp. ו- X.japonica, decant המדגם המוכתם לתוך צלחת 60 מילימטר ללא שימוש במדפים.
עם פינצטה טבעתית, מעבירים בעדינות את הדגימות לתבשיל נוסף של 60 מ"מ מלא במים מזוקקים כדי לשטוף תווי כתם מוגזמים מפני השטח. לאחר מכן, ציירו 100 מיקרוליטרים של 0.5% התעוררו לתוך קצה כחול מיקרופיפיט 1000 מיקרוליטר והצב אותו על קרח כדי להקשיח. בעת טיפול הרמות'ו sp.
להוסיף 1000 microliters של 0.5% agarose לתוך תקע אגרוז בקצה. השתמש פינצטה טבעת להעביר בעדינות הרמות'ו sp. מן המנה 60 מילימטר לתוך הפתרון agarose בקצה.
עם מחט petiolate או פינצטה מדויקת, להתאים את המיקום ואת הכיוון של sp. Harmothoe כך chaetae אינם כפופים באופן לא טבעי. ודאו שאין בועות, ולאחר מכן מניחים את הקצה על הקרח כדי להקשיח את ההתעוררות.
כאשר מטפלים בדגימות שבריריות כמו X.japonica, השתמשו במיקרופיגט כדי להוסיף 1000 מיקרוליטרים של מים מזוקקים לקצה הכחול עם תקע אגרוז מוקשח. מקם את X.Japonica במים מזוקקים, כך שהוא יציב בין הקירות של הקצה. עבור דגימות קטנות יותר, ניתן להשתמש בקצה צהוב מיקרופיפיט 200 מיקרוליטר.
במקרה זה, השתמש 30 microliters של agarose עבור התקע, ולהוסיף 200 microliters של אגרוז או מים מזוקקים. לאחר מכן, חותכים את הקצה של קצה כחול micropipette חדש, 1000 מיקרוליטר, ולהכניס את קצה הקצה המחובר לתוך הקצה החדש. מניחים חימר על שלב ההרכבה microCT ולהגדיר את הטיפים עם המדגם בפנים על החימר.
מיד לאחר הרכבת הדגימות, הפעל את קרן הרנטגן ב 80 קילו-וולט ו 100 מיקרואמפ. תוך כדי התבוננות בתדמית שידור קרני הרנטגן, הזיזו את הבמה כך שניתן יהיה לראות את המדגם כולו על ידי לחיצה על כפתורי ציר x ו- z, ועל ידי כוונון ידני של ידית ציר y על במת ההרכבה. התאימו את תנאי החדות של התמונה כך שניתן יהיה לצפות במבנים הפנימיים.
התאם את כיוון המדגם על ידי שינוי זווית הצינור בחימר. סובב את השלב ב- 90 מעלות על-ידי הגדרת ציר הסיבוב ל- 90 ולחיצה על לחצן תנועה יחסית. בצע את אותו תמרון ארבע פעמים כדי להשלים סיבוב מלא.
כבה ידנית את קרן הרנטגן בכל פעם שהדלת לדוגמה נפתחת, אלא אם המערכת מכבה אותה באופן אוטומטי. עכשיו לחץ על כפתור ציר z ולהתאים באופן ידני את הידית ציר y כדי להזיז את שלב ההרכבה, כך המדגם הוא במרכז התצוגה. להפוך את הבמה על ידי 90 מעלות ולהתאים את המדגם למרכז שוב.
להפוך את השלב 90 מעלות שלוש פעמים נוספות, ולהתאים לפי הצורך כדי להיות בטוח כי המדגם נמצא במרכז הנוף מכל הכיוונים. לאחר מכן, לחץ על לחצן ציר הרנטגן כדי להזיז את הבמה לאורך ציר ה- x לכיוון מקור קרן הרנטגן כדי להגדיל את הדגימה, ולהתאים לפי הצורך כך שהיא תתאים רק לתצוגה. סובב את הבמה והתאם לפי הצורך כדי לוודא שהדגימה מתאימה לתצוגה מכל הכיוונים.
כוונן את תנאי הסריקה ולאחר מכן התחל בסריקה. בניסוי זה, הדמיית microCT בוצעה על אקטין אקווינה, הרמות'ו sp. ו Xenoturbella japonica לאחר הכתם עם 25% הפתרון של Lugol.
הכתמים שיפרו בהצלחה את הניגודיות של המבנים הפנימיים בכל הדגימות, ואפשרו תצפיות על רקמות רכות פנימיות. שיטה זו ישימה דגימות שבירות גם עם נזק חיצוני, כפי שניתן לראות מן הדגימה X.japonica עם אפידרמיס פגום קשות. ערכת נתונים אחת ברזולוציה גבוהה של דגימה שלמה שוחזרה עבור הרמות'ו sp.
ו-X.japonica מסריקות מרובות שבוצעו בחלקים שונים אך חופפים של הדגימה. הקפד להגדיר את המדגם בצינור או בקצה ולהסתדר הצינור או קצה microCT, כך שהוא לא זז במהלך הסריקה. הנתונים המתקבלים מהליך זה יכולים לשמש לשחזורי תמונה תלת-מימדיים, המאפשרים לחוקר להבין באופן מלא הן מורפולוגיה פנימית והן מורפולוגיה חיצונית של המדגם.
כל מערכות המיקרו-CT משתמשות בקרני רנטגן, אך הפרטים עשויים להיות שונים ממערכת אחת לאחרת, לכן הקפד לעקוב מקרוב אחר ההוראות של כל מערכת.
