마이크로 CT는 형태학의 다양성으로 인해 해양 무척추 동물에 널리 적용되지 않았습니다. 우리의 방법은 형태에 적합한 모든 각도에서 시료를 쉽게 장착 할 수 있습니다. 그것은 물, 점토 및 튜브와 같은 일반적인 재료로 수행 할 수 있으며, 해당하는 경우 긴 벌레에서 둥근 공에 이르기까지 다양한 모양의 샘플을 수행 할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 일본 국립 유전학 연구소의 기술자 인 아키테루 마에노 (Akiteru Maeno)가 될 것입니다. 시작하려면 250밀리리터 원뿔 플라스크에 증류수 100밀리리터에 500밀리리터의 아가로즈를 용해하여 0.5%의 아가로즈를 준비하고, 플라스크를 800와트의 힘으로 전자레인지에 넣고 약 1~3분간 가열하십시오. 실온에서 플라스크를 식힙니다.
A.equina와 같은 1000 마이크로 리터 마이크로 피펫 블루 팁에 맞지 않는 대형 샘플을 먼저 증류수가있는 60mm 접시에 스테인드 샘플을 배치하여 표면에서 과도한 염색 액을 씻어 낸다. 50 밀리리터 튜브에서 거품을 만들지 않고 0.5 %의 아가로즈 5 밀리리터를 부드럽게 붓습니다. 아가로즈를 경화하기 위해 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
그런 다음 튜브에 0.5 %의 아가로즈 20 밀리리터를 추가하고 아가로즈가 굳기 시작할 때까지 얼음 위에 놓고 집게를 사용하여 아가로즈 내에 표본을 배치하십시오. 체형이 수직이되도록 시편의 위치를 조정합니다. 얼음 위에 아가로즈를 굳게 한다.
마이크로CT 장착 단계에 점토를 놓고 점토에 50 밀리리터 튜브를 놓습니다. 하모토 스프 및 X.japonica와 같은 1000 마이크로 리터 마이크로 피펫 블루 팁에 맞는 작은 샘플을 집게를 사용하지 않고 60mm 접시에 넣습니다.
링 핀셋을 사용하여 샘플을 증류수로 채워진 또 다른 60mm 접시에 부드럽게 전달하여 표면에서 과도한 스테인링 솔루션을 씻어냅니다. 다음으로, 100마이크로리터 마이크로피펫 블루 팁에 0.5%의 아가로즈 100마이크로리터를 넣고 얼음 위에 올려 굳어지게 합니다. 하모토를 취급할 때.
팁의 아가로즈 플러그에 0.5%의 아가로즈 1000마이크로리터를 추가합니다. 링 핀셋을 사용하여 60mm 접시에서 끝에 있는 아가로즈 용액으로 하모토슈 스프를 부드럽게 전달합니다.
페티올레이트 바늘이나 정밀 핀셋으로 하모트호의 위치와 방향을 조정하여 채태가 부자연스럽게 구부러지지 않도록 합니다. 거품이 없는지 확인한 다음 얼음 위에 팁을 놓아 아가로즈를 강화합니다.
X.japonica와 같은 깨지기 쉬운 샘플을 처리할 때 마이크로 파이프를 사용하여 강화된 아가로즈 플러그를 사용하여 1000 마이크로리터의 증류수를 파란색 팁에 추가합니다. X.Japonica를 증류수에 배치하여 팁의 벽 사이에 안정되도록 합니다. 더 작은 샘플의 경우 200 마이크로리터 마이크로피펫 옐로우 팁을 사용할 수 있습니다.
이 경우, 플러그에 아가로즈 30 마이크로리터를 사용하고, 아가로즈 또는 증류수 200 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 팁을 1,000마이크로리터 마이크로피펫 블루 팁에서 잘라내고 연결된 팁의 끝을 새 팁에 삽입합니다. 마이크로CT 장착 단계에 점토를 놓고 점토 내부에 샘플이있는 팁을 설정합니다.
시료를 장착한 후 즉시 80킬로볼트와 100마이크로앰프에서 엑스레이 빔을 켭니다. X선 전송 이미지를 관찰하는 동안 x 및 z축 버튼을 클릭하고 장착 단계에서 y축 노브를 수동으로 조정하여 전체 샘플을 볼 수 있도록 스테이지를 이동합니다. 내부 구조를 관찰할 수 있도록 이미지의 대비 조건을 조정합니다.
점토에서 튜브의 각도를 변경하여 샘플의 방향을 조정합니다. 회전 축을 90으로 설정하고 상대 이동 버튼을 클릭하여 스테이지를 90도 회전합니다. 전체 회전을 완료하기 위해 동일한 기동을 네 번 수행합니다.
시스템이 자동으로 꺼지지 않는 한 샘플 도어가 열릴 때마다 X선 빔을 수동으로 끕니다. 이제 z축 버튼을 클릭하고 y축 노브를 수동으로 조정하여 마운팅 스테이지를 이동하여 샘플이 뷰의 중심에 있도록 합니다. 스테이지를 90도 돌리고 샘플을 다시 중심으로 조정합니다.
스테이지 90도를 세 번 더 돌리고 필요에 따라 조정하여 샘플이 모든 방향에서 뷰의 중심에 있는지 확인합니다. 그런 다음 x축 버튼을 클릭하여 x-ray 빔 소스를 향해 x축을 따라 스테이지를 이동하여 샘플을 확대하고 필요에 따라 조정하여 뷰에 만 맞도록 조정합니다. 스테이지를 돌리고 필요에 따라 조정하여 샘플이 모든 방향에서 뷰 내에 맞는지 확인합니다.
스캔 조건을 조정한 다음 스캔을 시작합니다. 이 실험에서, 마이크로CT 화상 진찰은 25% Lugol의 해결책으로 염색한 후에 Actinia equina, Harmothoe sp. 및 제노투르벨라 자포니카에 수행되었습니다.
염색은 모든 표본에서 내부 구조의 대비를 성공적으로 향상시켜 내부 연조직의 관찰을 가능하게 했습니다. 이 방법은 외부 손상에도 취약한 시편에 적용되며, X.japonica 표본에서 심하게 손상된 표피를 볼 수 있습니다. 전체 표본의 단일 고해상도 데이터 집합이 하모트호 스프를 위해 재구성되었습니다.
및 여러 검사에서 X.japonica는 표본의 다르지만 겹치는 부분에서 수행. 튜브 또는 팁에 샘플을 설정하고 스캔 하는 동안 이동 하지 않도록 마이크로 CT에 튜브 또는 팁을 장착 해야 합니다. 이 절차에서 얻은 데이터는 3차원 이미지 재구성에 사용될 수 있으므로 연구원은 샘플의 내부 및 외부 형태를 모두 완전히 이해할 수 있습니다.
모든 microCT 시스템은 엑스레이를 사용하지만 세부 사항은 한 시스템과 다른 시스템으로 다를 수 있으므로 각 시스템의 지침을 밀접하게 따르십시오.
