Микро КТ не была широко применена к морским беспозвоночным из-за их разнообразия в морфологии. Наш метод позволяет легко монтаж образцов под любым углом подходит для его морфологии. Это может быть выполнено с общими материалами, такими как вода, глина, и трубки, и если это применимо, к образцам с различными формами, от длинного червя до круглого шара.
Демонстрацией процедуры будет Акитеру Маено, специалист Национального института генетики, Япония. Для начала приготовьте 0,5%агарозу, растворив 500 миллиграммов агарозы в 100 миллилитров дистиллированной воды в 250-миллилитровой конической колбе, и поместите колбу в микроволновую печь мощностью 800 Вт, чтобы нагреть около одной-трех минут. Охладить колбу при комнатной температуре.
Чтобы смонтировать большие образцы, которые не вписываются в 1000-микролитер микропайпет синий кончик, таких как A.equina, первое место окрашенных образца в 60-миллиметровой тарелке с дистиллированной водой, чтобы смыть чрезмерное окрашивание раствора с поверхности. В 50-миллилитровую трубку аккуратно залейте пять миллилитров 0,5%агарозы, не делая пузырьков. Поместите трубку на лед, чтобы затвердеть агарозу.
Затем добавьте 20 миллилитров 0,5%агарозы в трубку, поместите на лед, пока агароза не начнет затвердевать, и используйте типсы, чтобы поместить образец в агарозу. Отрегулируйте положение образца так, чтобы его ось тела была вертикальной. Затвердеть агарозу на льду.
Поместите глину на сцену монтажа microCT и установите 50-миллилитровую трубку на глину. Чтобы смонтировать небольшие образцы, которые вписываются в 1000-микролитровый микропипет синий кончик, такие как Harmothoe sp. и X.japonica, декантировать окрашенные образца в 60-миллиметровое блюдо без использования миппов.
С помощью кольцевого пинцета аккуратно перенесите образцы в другое 60-миллиметровое блюдо, наполненное дистиллированной водой, чтобы смыть с поверхности чрезмерное окрашивание раствора. Затем нарисуйте 100 микролитров 0,5%agarose в 1000-микролитровый микропипетер синий кончик и поместите его на лед, чтобы затвердеть. При обработке Harmothoe sp.
добавить 1000 микролитров 0,5%agarose в агарозы плагин в кончике. Используйте кольцевые пинцеты, чтобы аккуратно перенести Harmothoe sp. из 60-миллиметрового блюда в раствор агарозы в кончике.
С помощью иглы петиолата или точного пинцета, отрегулируйте положение и ориентацию Harmothoe sp., чтобы chaetae не согнуты неестественно. Убедитесь, что нет пузырьков присутствуют, а затем поместить кончик на лед, чтобы затвердеть агарозы.
При обработке хрупких образцов, таких как X.japonica, используйте микропипет, чтобы добавить 1000 микролитров дистиллированной воды в синий кончик с затвердевшей вилкой агарозы. Распоить X.Japonica в дистиллированной воде так, чтобы она была стабильной между стенами кончика. Для небольших образцов можно использовать 200-микролитровый микропипет желтый наконечник.
В этом случае используйте 30 микролитров агарозы для вилки и добавьте 200 микролитров агарозы или дистиллированной воды. Затем отрежьте кончик нового, 1000-микролитрового микропипета синим наконечником, и вставьте кончик подключенного наконечника в новый наконечник. Поместите глину на стадии монтажа microCT и установите кончики с образцом внутри на глине.
Сразу после монтажа образцов включите рентгеновский луч на 80 киловольт и 100 микроампер. Наблюдая за рентгеновским изображением передачи, переместите сцену так, чтобы весь образец можно было увидеть, нажав на кнопки x и z-axis, а также вручную отрегулив ручку y-оси на стадии монтажа. Отрегулируйте контрастные условия изображения так, чтобы можно было наблюдать внутренние структуры.
Отрегулируйте ориентацию образца, изменив угол трубки в глине. Поверните этап на 90 градусов, установив ось вращения до 90 и нажав на кнопку относительного движения. Выполните один и тот же маневр четыре раза, чтобы завершить полное вращение.
Вручную выключите рентгеновский луч каждый раз, когда дверь образца открыта, если система не выключит его автоматически. Теперь нажмите на кнопку z-оси и вручную отрегулируйте ручку y-axis, чтобы переместить этап монтажа так, чтобы образец был в центре представления. Поверните сцену на 90 градусов и снова отрегулируйте образец к центру.
Поверните сцену еще на 90 градусов и отрегулируйте по мере необходимости, чтобы убедиться, что образец находится в центре вида со всех сторон. Затем нажмите на кнопку «Х-ось», чтобы переместить сцену по оси x к источнику рентгеновского луча, чтобы увеличить образец, и отрегулируйте по мере необходимости так, чтобы он просто вписывался в представление. Поверните сцену и отрегулируйте по мере необходимости, чтобы убедиться, что образец вписывается в вид со всех сторон.
Отрегулируйте условия сканирования, а затем начните сканирование. В этом эксперименте, microCT изображения были выполнены на Actinia equina, Harmothoe sp. и Xenoturbella japonica после окрашивания с 25%Lugol решение.
Окрашивание успешно усиливает контраст внутренних структур во всех образцах, позволяя наблюдения внутренних мягких тканей. Этот метод применим к хрупким образцам даже при внешних повреждениях, как видно из образца X.japonica с сильно поврежденным эпидермисом. Для Harmothoe sp был реконструирован единый набор данных высокого разрешения целого образца.
и X.japonica из нескольких сканирований, выполненных на разных, но перекрывающихся частях образца. Убедитесь в том, чтобы установить образец в трубке или наконечник и смонтировать трубку или кончик в microCT так, чтобы он не двигается во время сканирования. Данные, полученные в результате этой процедуры, могут быть использованы для 3-D реконструкции изображения, что позволяет исследователю полностью понять как внутреннюю, так и внешнюю морфологию образца.
Все системы microCT используют рентгеновские лучи, но специфика может отличаться от одной системы к другой, поэтому, пожалуйста, убедитесь, что внимательно следовать инструкциям каждой системы.
