Aquí presentamos un ensayo simple de cribado del núcleo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de Aflatoxina en granos de maíz que expresan una proteína antifúngica. Usando una proteína fluorescente verde que expresa la cepa Aspergillus flavus, monitoreamos la infección y propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. Este ensayo simple proporciona un medio confiable para evaluar la capacidad del grano de maíz para resistir la infección por Aspergillus flavus y la producción de Aflatoxina.
Los resultados de este ensayo de laboratorio realizado en condiciones controladas en núcleos maduros se correlacionan bien con los resultados de la infección en condiciones de campo. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Rajtilak Majumdar, un postdoctorado de nuestro laboratorio, junto con Christine Sickler y David Ambrosio, técnicos de ciencias biológicas también de nuestro laboratorio. Para empezar, pega 20 tapas de presión de dos mm en una placa Petri para crear tapas KSA.
Deje secar el pegamento durante 48 horas antes de usar las tapas. En un armario de seguridad biológica rocía una bandeja de bioensayo cuadrada con 70% de etanol en agua. Deje que la bandeja se seque al aire.
Agregue papel de cromatografía estéril a la bandeja seca. Rocíe nueve de las tapas KSA con 70% de etanol y déjelas secar al aire. A continuación, coloque las tapas en la bandeja de bioensayo.
Para cada línea de maíz transgénico que se está probando, seleccione 20 granos sin daños y colóquelos en un tubo centrífugo de 50 ml. Usando un microscopio estéreo de mesa seleccione sólo kernels no dañados para el ensayo. Los granos dañados son más susceptibles para el ataque de Aspergillus y producen más Aflatoxina, sesgando así los resultados y no representando los verdaderos rasgos antifúngicos o antimicrobianos de la variedad.
Añadir 70% de etanol a cada tubo. Deje que los granos se esterilizan durante cuatro minutos mientras ocasionalmente los agitan suavemente. Después de esto verter suavemente el etanol y enjuagar suavemente los granos en agua estéril desionizada tres veces.
Obtenga un cultivo de seis días de Aspergillus flavus mancha 70 expresando GFP cultivado en el medio V8. Añadir 20 ml de estéril 0,02%Tritón X-100 en agua desionizada. Y usa un lazo estéril para raspar las esporas.
Pipetear el inóculo y transferirlo a un vaso estéril de 300 ml. Prepara una dilución de cinco veces con 0.02%Triton X-100 y usa un hemocicómetro para realizar un recuento de esporas. Diluir de nuevo si es necesario para obtener 100 ml con una concentración de cuatro millones de esporas por ml.
Vierte el inóculo en un vaso vacío. Coloque los granos en un vaso de precipitados estéril de 300 ml con una barra de agitación y revuelva durante tres minutos. Usando fórceps transfiera los granos a la placa de bioensayo, asegurándose de colocar sólo un núcleo en cada tapa.
Añadir 30 ml de agua desionizada al fondo de cada bandeja de bioensayo. E incubar a 31 grados centígrados durante siete días. Después de siete días de inoculación con A.flavus, tome fotos de cuatro kernels que fueron designados para el análisis microscópico y la fotografía.
Luego use un tejido blando y agua desionizada para limpiar el exterior de los granos. Realice secciones longitudinales de los granos e inmediatamente tome fotografías bajo el microscopio fluorescente. Para preparar los granos para el análisis, limpie el exterior de los granos restantes con un tejido blando y agua desionizada.
Coloque cuatro granos, que constituyen un rep, en un vial de policarbonato de tapa de tornillo de 15 ml que contenga dos bolas de acero inoxidable. Congele inmediatamente los viales en nitrógeno líquido y guárdelos a 80 grados centígrados hasta que estén listos para continuar con el procesamiento y análisis. Cuando esté listo, retire los granos del congelador y utilice un homogeneizador para molerlos a 1500 rpm durante tres minutos.
Utilice los mismos materiales de suelo para el análisis de GFP, la determinación de Aflatoxinas y el análisis molecular, de modo que todos los valores sean representativos de las muestras. Mientras que se recomienda un mínimo de tres réplicas, más siempre es mejor dependiendo de la disponibilidad de kernels de buena calidad. En este estudio, los embriones inmaduros de las líneas HI-II de maíz se transforman utilizando la cepa Agrobacterium tumefaciens EHA101 que contiene el vector de destino de la planta final que expresa el gen Lablab purpureus AILP bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de coliflor.
La amplificación de PCR del gen AILP objetivo mostró un amplón de 548 bp observado sólo en las líneas de maíz transgénico. El gen AILP mostró expresión en las líneas transgénicas, mientras que no se observó ninguna expresión AILP en las plantas de control. Las esporas germinantes en etapa temprana se exponen a extractos de hojas crudas de plantas jóvenes de maíz transgénico durante 20 horas.
La alta longitud completa de las esporas expuestas a extractos de hojas transgénicas muestran una reducción de 58 a 80% en comparación con el control negativo. La cepa A.flavus utilizada contiene un reportero de GFP que permite el monitoreo y cuantificación del crecimiento de hongos en tiempo real. Se observa una reducción significativa de la fluorescencia de la GFP en los granos transgénicos de AILP en comparación con el control negativo isogénico.
Se observa una reducción significativa en el crecimiento de hongos para las líneas AILP cuatro y cinco, 69% y 72%, respectivamente. Las otras líneas muestran una reducción de 35 a 60% de reducción en comparación con los núcleos de control. Se observó una reducción del 62 al 88% en el contenido de Aflatoxina en los núcleos AILP en comparación con el control.
Se considera que la línea cuatro tiene el contenido más bajo de Aflatoxina en 486 ng por g, seguido de otras líneas que van que tenían contenidos que oscilaban entre 640 y 1498 ng por g en los granos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales, como el uso de un fluorómetro para cuantificar la GFP y como su crecimiento fúngico. Los kits comerciales inmunoso o HPLC o EPLC se pueden utilizar para realizar la cuantificación de Aflatoxina.
La disponibilidad de KSA proporciona un medio rápido y sencillo para determinar la resistencia a la contaminación por Aflatoxina. Las diferentes líneas de reproducción de maíz se pueden evaluar rápidamente utilizando esta técnica. Si bien el ensayo de cribado del núcleo no es peligroso, el operador debe protegerse de la exposición a las esporas de Aspergillus flavus, utilizar el equipo de protección adecuado.
