La imagen microscópica se realizó a través de los servicios del Centro de la Universidad Estatal de Michigan de Microscopía Avanzada. Callos de maíz fue adquirido desde el Centro de Transformación de maíz de Iowa State University. Los autores desean agradecer a Jeffrey R. Weatherhead del Laboratorio de Investigación de Plantas MSU por su asistencia técnica en el análisis de carbohidratos. Esta investigación fue generosamente financiado por el Programa de Maíz de Marketing de Michigan (CMPM) y el Consorcio para la Investigación de Biotecnología Vegetal (CPBR).

1. Preparación de dsRNAi construcciones utilizadas para el descenso de regulación de ZmCCR1 <ol><li> Primers específicos de genes de diseño que incluyen sitios de enzimas de restricción necesarios para hacer una dsRNAi construir a ronda el gen ZmCCR1. Dos conjuntos de cebadores fueron diseñados para amplificar dos segmentos de fragmentos de ADNc ZmCCR1:. Un fragmento de 523 pb desde el nucleótido 748 hasta 1271, y un fragmento de 285 pb desde el nucleótido 986 hasta 1271 El ADNc ZmCCR1 fue proporcionada por el Instituto del Genoma de Arizona (AGI). Más detalles se describen en la Figura 1. </li><li> Amplificar el fragmento grande por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la plantilla de cDNA ZmCCR1 utilizando los ZmCCR1_748F_BglII cebadores (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;) y ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;). Amplificar el fragmento más pequeño (285 pb) utilizando los cebadores ZmCCR1_986F_BglII (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;) y un ZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;). </li><li> Individualmente ligar los fragmentos en pGEM-T Easy siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Realizar Mini-Prep de aislamiento de ADN plásmido de los transformantes individuales, cada uno que contiene el pGEM-T construye usando un kit de plásmido mini-preparación comercial. </li><li> Digerir tanto el pGEM-T :: ZmCCR1 (523 pb) y ImpactVector (IV) -1,1 (vector de expresión citoplasma) con tanto BglII y NcoI. </li><li> Se liga el fragmento grande se purificó en gel ZmCCR1 digeridos (523 pb) en el gel digerido IV-1.1 purificada. </li><li> Se digiere el pGEM-T :: ZmCCR1 (285 pb) y IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb) tanto con BglII y SacI para insertar el pequeño fragmento en el IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb). </li><li> Se liga el fragmento pequeño de gel digerido ZmCCR1 purificado (285 pb) en el gel digerido IV-1.1 purificado :: ZmCCR1 (523 pb). </li><li> Clonar tanto 523 pb y 285 pb fragmentaciónTS a IV-1.1 para hacer que el ZmCCR1 ARNi construir, que tiene una secuencia de repetición invertida 285 pb con un espaciador 238 pb en el medio de los fragmentos de repetición invertida (véase la Figura 1). </li><li> Transferencia de esta construcción en Escherichia coli (E. coli), crecer y realizar un aislamiento de ADN plásmido tamaño-midi de preparación para obtener el plásmido de ADN suficiente para la transformación genética del maíz. </li></ol> 2. Maíz Transformación Genética <ol><li> Preparación de partículas de tungsteno <ol><li> Coloque 60 mg de perlas de tungsteno (M10) en un tubo de 1,5 ml y se lava con 1 ml de etanol al 70% por agitación rotatoria durante 2 min. Incubar durante 10 minutos a 23 ° C y centrifugar a 18.894 xg durante 2 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar 3 veces con 1 ml de etanol 100%, centrifugando durante 2 min y descartar el sobrenadante. Añadir 1 ml de 50% de glicerol estéril para llevar la concentración de micropartículas de 60 mg / ml. </li></ol></li><li> Preparación de ADN para el bombardeo <ol><li> Plel as de los 50 l (3 mg) de perlas de tungsteno preparadas en glicerol al 50% en un tubo de 1,5 ml. Añadir 5 l (1 mg) de IV-1.1 :: plásmido de ADN ARNi ZmCCR1, 50 l de CaCl2 2,5 M, y 20 l de 0,1 M espermidina. Vórtice brevemente entre cada adición de los reactivos anteriores. </li><li> Vortex el tungsteno-ADN del grano brevemente la mezcla y se centrifuga a 18.894 xg durante 30 segundos. Retirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 140 l de etanol al 70%. Retirar el líquido y desecharlo. Añadir 140 l de etanol al 100%. Retirar el líquido y desecharlo. </li><li> Añadir 48 l de etanol al 100%. Utilizar inmediatamente o almacenar en hielo durante un máximo de 4 horas antes del bombardeo. </li></ol></li><li> Bombardeo <ol><li> Coloque una callos de maíz embriogénico 3-5 cm de diámetro Hi-II (proporcionado desde el Centro de transformación de maíz, de la Universidad del Estado de Iowa) en el medio de 100 mm placas de Petri que contienen medio N6OSM 32 (como osmotium) al menos 4 horas antes de la bombardeo. </li><li> Prepare la PSD-1000/He dispositivo de partícula de suministro de acuerdo con las instrucciones del fabricante 33. </li><li> Esterilizar pared de la cámara con etanol al 70%. Cargue el disco de ruptura de 650 psi estéril en tapa de retención estéril. Spread 5-6 l de la solución de M10-ADN sobre la superficie de un macroportador, brevemente seco. Macroportador carga y detener pantalla en microsoporte ensamblaje de lanzamiento. </li><li> Coloque microsoporte ensamblaje de lanzamiento y los callos de maíz en la cámara a una distancia seleccionada de la pantalla de detención (L2 = 6 cm) y cierre la puerta. Acelerar en un vacío de 27 psi en contra de una pantalla de malla de alambre. </li><li> Pulse el botón de disparo hasta ráfagas de disco de ruptura y de la presión de helio medidor llega a cero. Suelte el botón de disparo. </li><li> Incubar los callos bombardeados en una placa de Petri que contiene N6OSM (medio osmótico) 32 durante 16 horas en la oscuridad a 27 ° C. Romper los callos en unos diez piezas y la transferencia a N6E (medio de inducción de callo) 32 en placas de Petri y se incuba durante 5 días in la oscuridad a 27 ° C. </li></ol></li><li> Selección <ol><li> Después de 5 días en N6E, transferir los callos en un medio N6S (medio de selección) 32. Subcultura todo callos en un medio de selección, cada 30 días durante 8-12 semanas sin alterar la estructura de los callos. </li><li> Después de aproximadamente 8-10 semanas, los sectores de rápido crecimiento blancos crecerán fuera de la no proliferación y calli madre parcialmente necrótica. Impuestos especiales de los tejidos de rápido crecimiento blancas y la subcultura a medio de selección fresco (N6S) 32 y continuar incubar que el anterior. </li></ol></li><li> Regeneración <ol><li> Transferir la callos embrionarios blanco y de crecimiento rápido en medio de regeneración 32 y se incuba como anteriormente durante 1 semana. Cambie los callos embriogénicos regenerar a un período de 16 horas luz del día y 8 horas de oscuridad a 25-27 ° C </li><li> Transferir la regeneración dispara en el medio de enraizamiento 32 en un tubo de ensayo de vidrio después de 3-4 semanas, continúe incubar que el anterior. Después r sustancialAparece el desarrollo OOT, lávese cuidadosamente las raíces bajo el agua del grifo, y luego trasplantar las plántulas de 4 &quot;macetas con tierra. Cubra las ollas con bolsas de plástico para mantener la humedad. Después de 2 días hacen agujeros pequeños de las bolsas de plástico. Después de 5-6 días retirar las bolsas de plástico. Continuar incubar como anteriormente para otros 5-6 días. </li></ol></li><li> Invernadero <ol><li> Transfiera las plantas de semillero en macetas de 18 &quot;con el suelo y mantener en sol de verano completo o la luz de efecto invernadero. Las plantas regeneradas iniciales se llaman T 0, mientras que las primeras semillas pertenecen a la generación T 1. </li></ol></li></ol> 3. Ensayo histológico <ol><li><ol><li> Fijar las de maíz hoja mediados de los nervios en 5 ml de formalina al 10% tamponada neutra. </li><li> Proceso de vacío y se infiltran con parafina en un procesador de tejidos usando un procesador de tejidos. </li><li> Incrustar los tejidos en parafina utilizando una estación de incrustación Histocentre III. </li><li> Retire el exceso de parafina de los bordes de una vez bloqueks se enfrían. </li><li> Muestra en la Sección 4-5 micras con un micrótomo usando un microtomo. </li><li> Coloque las secciones en portaobjetos de microscopio y seca en una incubadora de 56 ° C durante 2-24 horas. Haga secciones estén totalmente adheridos a la diapositiva. </li><li> Desparafinar secciones en dos cambios de xileno durante 5 min a 23 ° C. </li><li> Hidrato se desliza a través de dos cambios de etanol al 100% durante 2 min y dos cambios de etanol 95% durante 2 min a 23 ° C. </li><li> Enjuague las secciones en agua corriente durante 2 min. </li><li> Teñir con un 0,05% de toluidina O azul durante 1-2 minutos y enjuagar brevemente con ddH 2 O. </li><li> Coloque un cubreobjetos sobre las muestras con aceite de inmersión y visualización con microscopia de luz. </li></ol></li><li> Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) <ol><li> Fijar los de maíz hoja mediados de los nervios-seccionadas transversal en 4% de glutaraldehído y 0,1 M de tampón de fosfato de sodio (pH 7,4) a 4 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Brevemente enjuague las muestras en la memoria intermedia, ellos se deshidrataron en unaserie de etanol (25%, 50%, 75%, y 95%) durante 10-15 min en cada gradación y etanol al 100% durante 10 min, 3x. </li><li> Secar los deshidratados maíz hoja mediados de nervios transversales de sección en una secadora de punto crítico que utiliza dióxido de carbono líquido como fluido de transición. </li><li> Montar las muestras secas en los talones de aluminio mediante fichas de carbono de alto vacío </li><li> Cubra las hoja de maíz a mediados de los nervios montados en los talones de aluminio de oro (de aproximadamente 20 nm de espesor) en un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica purgado con gas argón. </li><li> Examine las muestras recubiertas en un JEOL JSM-6400V (emisor de electrones hexaboruro lantano) microscopio electrónico de barrido. </li><li> Las imágenes digitales fueron fotografiados utilizando un software Pro Analysis (versión 3.2). </li></ol></li></ol> 4. Lignina Klason Medición <ol><li> Molino de las muestras a través de un tamiz de 2 mm. </li><li> Utilizar un analizador de humedad para determinar el contenido de humedad de cada muestra y registrar el valor. </li><li> Pesar aproximadamente 1,5 g de cada muestra y se registra la masa. EXtract las muestras usando agua para la primera extracción, seguido de etanol para la segunda extracción usando un extractor automatizado disolvente (3 ciclos por extracción, ~ 14 min por ciclo) o aparato de Soxhlet (8 horas por extracción). (Nota: Este paso elimina extractivos que pueden condensarse durante la hidrólisis ácida e interferir con la medición exacta de la lignina, lo que aumenta la aparente contenido de lignina Klason.) </li><li> Secar las muestras extraídas a 45 º C durante la noche, y luego deje que se enfríen en el desecador y pesar de nuevo. </li><li> Establecer una incubadora a 30 ° C. Mide 0,3 g de cada uno, muestra extraída seco en tubos con tapa de rosca de alta presión (por triplicado por muestra se recomienda) y registrar los pesos a 0,1 mg. Añadir 3 ml de 72% de H 2 SO 4 a cada tubo de presión. </li><li> Mezclar la muestra utilizando una varilla de agitación de vidrio o teflón. Deje la varilla de agitación en el tubo hasta que el agua se añade después de la incubación. </li><li> Colocar los viales en una incubadora en síT a 30 ° C y 150 rpm durante 60 min. Después de 1 hora añadir 84 ml de agua desionizada para diluir la concentración de ácido al 4% y mezclar con la varilla de agitación. Tenga cuidado de no dejar grandes cantidades de muestra en los lados del vial por encima de la línea de agua. </li><li> Sellar herméticamente las trabas de todos los viales y colóquelos en un bastidor de metal o de grandes vasos. Autoclave a 121 ° C utilizando un ciclo de esterilización líquido durante 1 hora. Deje que se enfríen a temperatura ambiente antes de abrir. </li><li> Pre-ash los crisoles filtrantes en un horno a 575 ° C durante al menos 4 horas. Permita que se enfríen los crisoles en un desecador durante al menos una hora. </li><li> Vacío filtrar la solución de cada tubo a través de un crisol separado, utilizando un adaptador de caucho para asegurar el crisol. Utilice agua desionizada para enjuagar las partículas restantes del tubo. </li><li> Secar el residuo de lignina a 105 ° C durante un mínimo de 4 horas. Anotar el peso del crisol seco y residuos. </li><li> Si se utiliza un 575 ° C, preEl fuego de las muestras sobre un mechero de Bunsen hasta que no haya humo o ceniza y luego colocar en el horno durante 24 horas, o si se utiliza un horno programable, no pre-ash y utilizar el siguiente programa: </li><li> Rampa de temperatura ambiente a 105 ° C y mantener durante 12 min. </li><li> Rampa a 250 º C a 10 º C / min y mantener durante 30 min. </li><li> Rampa a 575 ° C a 20 ° C / min y mantener durante al menos 180 minutos. </li><li> Retire los crisoles del horno y enfriar en un desecador. Pesar el crisol y ceniza. </li><li> Calcular el residuo insoluble en ácido mediante la siguiente ecuación: </li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> M PRE = Masa de la biomasa antes de extraer M POSTE = Masa de la biomasa post-extraída M VIAL = masa de la biomasa extraída añadió al vial M RESIDUOS = Masa de resid crisol y ligninaue M ASH = Masa del crisol y cenizas MC = Contenido de humedad de la biomasa pre-extraído, respecto al peso total 5. Análisis de carbohidratos <ol><li> Realice la pared celular de carbohidratos análisis basado en el Foster et al. (2010) Protocolo de 31. En resumen, Preparar alcohol residuo insoluble de liofilizado material vegetal. A continuación, hidrolizar el material con ácido trifluoroacético y combinar los derivados de monosacáridos solubilizadas a sus acetatos de alditol correspondientes. Analizar estos derivados volátiles por cromatografía de gases (GC) conectado a un espectrómetro de masas cuádruple. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La accesibilidad de las celulasas microbianas para plantar polisacáridos de la pared celular depende en gran medida del grado en el que se asocian con polímeros fenólicos 23. La tasa de conversión de biomasa lignocelulósica en azúcar fermentable se correlaciona negativamente con el contenido de lignina depositado en las paredes celulares de las plantas secondadry. Esta correlación se atribuye a las propiedades físicas de la lignina como hidrofobicidad 24, la heterogeneidad química, y la au...

La producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica es altamente deseable debido a su abundancia actual en los EE.UU. 1, y en el caso de la cosecha sostenible de los residuos agrícolas y forestales, la capacidad de no competir directamente por las tierras de cultivo utilizado para la alimentación animal y la producción de piensos. Sin embargo, a diferencia de grano de maíz, que es la principal fuente de biocombustible se está generando en los EE.UU., los materiales lignocelulósicos son significativamente más complejo y difícil de romper. Además de la hidratos de carbono de cadena larga, celulosa y hemicelulosa, que son las principales fuentes de azúcares durante la fermentación de materiales lignocelulósicos, muchos tipos de paredes de células vegetales también contienen lignina, un polímero de fenilpropanoides que proporciona fuerza, la defensa contra el ataque de patógenos, y la hidrofobicidad a las paredes celulares. Mientras que es necesario para el crecimiento vegetal y la supervivencia, la lignina también presenta una barrera significativa para la conversión enzimática con éxito de la celulosa y hemicelluperder a los azúcares solubles. Los materiales con alto contenido de lignina son generalmente materiales menos deseables, tanto para el biocombustible (a través de las vías de conversión biológica) y las industrias de pulpa y papel, debido a los impactos negativos sobre las características de procesamiento y la calidad del producto. Por lo tanto, la manipulación genética de los materiales vegetales para la reducción de la lignina en un nivel que no interfiera con la resistencia estructural de los cultivos y los sistemas de defensa podría ser importante para la reducción de los costos de producción, tanto para el biocombustible lignocelulósico y las industrias de pulpa y papel. En el maíz (Zea mays), la lignina es covalentemente reticulado para la hemicelulosa en la pared celular primaria a través de ferulato y puentes diferulato 2. El complejo lignina-hemicelulosa se une a las microfibrillas de celulosa a través de enlaces de hidrógeno, formando una matriz compleja que confiere la integridad y la fuerza a la pared celular secundaria. La resistencia mecánica de las paredes celulares de la planta está determinada en gran medida por el tipo de Lignin subunidades 3-5. En estudios anteriores, la alteración de las proporciones de las subunidades de lignina ha mostrado ninguna tendencia clara en la digestibilidad enzimática 6-11. Sin embargo, las reducciones en el contenido de lignina en general, muestran una mejora en las conversiones de 12,13 y pueden ser una clave para el aumento de la digestibilidad de la materia vegetal por las enzimas hidrolíticas incluyendo endocellulases, celobiohidrolasas, y β-glucosidasas 14. La ingeniería genética de regular el nivel de expresión de las transcripciones ha sido ampliamente practicada para mejorar características de los cultivos. Las técnicas avanzadas, incluyendo anti-sentido 15 y cosupresión 16 tecnologías, permiten efectiva la baja regulación de los genes diana. Completar gen knock-out también se ha conseguido utilizando construcciones de genes que codifican ARN intrón-empalmado con una estructura de horquilla 17. Además, una interferencia de ARN de doble cadena técnica (dsRNAi), es decir, un medio de expresión génica potente y eficazTor que funciona por cualquiera de focalización degradación de transcripción o traducción represión, proporciona un potente medio para inducir una amplia gama de efectos de supresión en el ARNm diana 18. Técnicas de silenciamiento génico muestran varias limitaciones. Estas técnicas no regulan con precisión el nivel de la transcripción y que podría causar efectos de silenciamiento inesperadas en otros genes homólogos. En este método, hemos empleado el bombardeo de partículas para llevar a la dsRNAi construye en el genoma de maíz. Hasta la fecha, una gran variedad de especies de plantas se han transformado con éxito utilizando bombardeo de partículas, transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, y los métodos de microinyección. En la transformación genética del maíz, el método de bombardeo de partículas es ventajoso con respecto a todos los otros métodos, ya que es el más eficiente. El bombardeo de partículas no depende de las bacterias, por lo que el método es libre de limitaciones biológicas, tales como el tamaño de los genes, especies de gen oigin, o el genotipo de la planta. El sistema de suministro de transgén física permite ADN de alto peso molecular y múltiples genes a ser introducidos en los genomas de plantas y en ciertos casos en los cloroplastos en alta eficiencia de transformación 19. La reducción de la lignina en el sistema vascular de la hoja de nervadura puede ser visualizado a través de microscopía electrónica de barrido (SEM) que es beneficioso para el examen de la topografía y la composición de las muestras. En las plantas de maíz, dos de la reductasa de cinamoílo-CoA reductasa (ZmCCR1: X98083 y ZmCCR2: Y15069) se encontraron genes en el genoma del maíz 20. Cinamoil-CoA reductasa cataliza la conversión de los ésteres hidroxicinamoil-CoA reductasa en aldehídos de cinamilo. Elegimos el gen ZmCCR1 para regular a la baja esta enzima debido a que el gen se expresa en todos los tejidos lignifying. Los 523 nucleótidos en el extremo 3 &#39;del gen ZmCCR1 se eligieron para un dsRNAi construir porque las secuencias parecían sermás diversa en comparación con los de ZmCCR2. Por lo tanto, la construcción dsRNAi ataría precisamente sólo para ZmCCR1, evitando fuera del objetivo silenciar a 21. Una construcción ZmCCR1_RNAi fue diseñado en el sistema de expresión citoplásmica ImpactVector1.1-tag (IV 1,1) que contiene el promotor específico de tejido verde, ribulosa-1, carboxilasa oxigenasa 5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO). Para estudiar los efectos de la dsRNAi construir en plantas transgénicas, se cuantificó el contenido de lignina. La medición de lignina Klason (insoluble en ácido) es conocido por ser más precisa en comparación con los métodos de cuantificación de lignina detergente ácido que solubilizan algunos de la lignina 22. Por lo tanto, la lignina Klason se midió en tallos de maíz transgénicas. Este procedimiento consiste en una hidrólisis ácida de dos pasos que convierte los carbohidratos poliméricos solubles en monosacáridos 23. A continuación, la biomasa hidrolizada se fraccionó en ácido Materi soluble e insolubleALS y la lignina insoluble en ácido se midió de acuerdo con estudios anteriores 23,24. Idealmente, el análisis de lignina debe incluir extracciones con agua y etanol antes de la etapa de hidrólisis, con el fin de eliminar los materiales solubles que pueden interferir con los resultados, y una combustión después de la hidrólisis del residuo de lignina para dar cuenta de cualquier ceniza presente en el residuo. Sin estos pasos, el contenido de lignina de la muestra podría ser inflado artificialmente. El método de integración global se presenta aquí, sin embargo, para nuestros experimentos hemos podido llevar a cabo estos dos pasos debido al pequeño volumen de material disponible para la prueba También se analizaron otros dos componentes de la pared celular, la celulosa y la hemicelulosa en la lignina líneas de maíz transgénico-hacia abajo regulado. Se ha informado de que las plantas transgénicas que han sido regulados hacia abajo, ya sea en su fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) 25, 4-cumarato: CoA ligasa (4CL) 26, o una de cinamilodeshidrogenasa l alcohol (CAD) 27 muestran un aumento de otros componentes estructurales de la pared celular. Como un primer paso en nuestros estudios, celulosa cristalina se midió utilizando el método Updegraff 28. Este método fue ideado originalmente para la determinación de la celulosa en un gran número de bacterias celulolíticas y hongos. Brevemente, las existencias de maíz molidos fueron tratados con Updegraff reactivo (ácido acético: ácido nítrico: agua) para eliminar la hemicelulosa, lignina, y xylosans. La celulosa cristalina fue completamente hidrolizada en glucosa a través de Saeman hidrólisis mediante la adición de H 2 SO 4. A continuación, la celulosa cristalina se ensayó usando el método colorimétrico de antrona 29. Para verificar si se cambiaron el contenido de hemicelulosa, los extractos de monosacáridos de tallos molidos se hidroliza usando ácido trifluoroacético, derivatizados utilizando el método del acetato de alditol y se analizaron por cromatografía de gases (GC) 30. Los procedimientos detallados para cel cristalinaanálisis de composición de contenido lulosa y de la matriz de polisacáridos se describen en Foster et al. (2010) 31. A continuación, describimos los procedimientos utilizados para la lignina baja regulación en el maíz a través de una tecnología de RNAi, la transformación por bombardeo de partículas, y el análisis de la lignina para la deconstrucción acelerada de maíz de biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables para los biocombustibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

Para facilitar el uso de la biomasa lignocelulósica como un recurso bioenergía alternativa, durante los procesos de conversión biológica, se necesita una etapa de pretratamiento para abrir la estructura de la pared celular de la planta, el aumento de la accesibilidad de los hidratos de carbono de la pared celular. La lignina, un material polifenólico presente en muchos tipos de pared celular, se sabe que es un obstáculo significativo a la enzima de acceso. Reducción en el contenido de lignina a un nivel que no interfiere con la integridad y la defensa del sistema estructural de la planta puede ser un paso importante para reducir los costes de la producción de bioetanol. En este estudio, hemos genéticamente las reguladas uno de los genes relacionados con la biosíntesis de lignina, cinamoil-CoA reductasa (ZmCCR1) a través de una técnica de interferencia de ARN de doble cadena. El constructo ZmCCR1_RNAi se integró en el genoma del maíz utilizando el método de bombardeo de partículas. Plantas de maíz transgénicas crecieron normalmente en comparación con las plantas de control de tipo salvaje y sin enterfering con el crecimiento de la biomasa o los mecanismos de defensa, con la excepción de la visualización de color marrón-coloración en plantas transgénicas hoja mediados de los nervios, las cáscaras y tallos. Los análisis microscópicos, en conjunción con el ensayo histológico, revelaron que las fibras de esclerénquima de hojas se apretó pero la estructura y el tamaño de otros componentes principales del sistema vascular no fue alterada. El contenido de lignina en el maíz transgénico se redujo en un 7-8,7%, se aumentó el contenido de celulosa cristalina en respuesta a la reducción de la lignina, hemicelulosas y se mantuvo sin cambios. Los análisis pueden indicar que el flujo de carbono podría haber sido desplazado de la biosíntesis de la lignina para la biosíntesis de la celulosa. Este artículo delinea los procedimientos utilizados para regular a la baja el contenido de lignina en el maíz a través de la tecnología del RNAi, y los análisis de la composición de la pared celular utilizado para verificar el efecto de las modificaciones en la estructura de la pared celular.

Hemos demostrado una reducción en el contenido de lignina en las plantas de maíz a través de ARNi. El método de transformación por bombardeo de partículas produjo alrededor del 30% de eficiencia trnasformation. El silenciamiento de los genes de ZmCCR1 se observó consistentemente en generaciones T0-T2. Los transgénicos lignina reducida crecieron de manera similar a las plantas de maíz de tipo salvaje, excepto para la visualización de la coloración marrón en el medio de la hoja de la costilla, la cás...

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Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Una interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) técnica se emplea para regular a la baja la coenzima A reductasa cinamoilo maíz gen (ZmCCR1) a un menor contenido de lignina de la planta. La lignina regulación a la baja de la pared celular se visualiza mediante análisis microscópicos y se cuantifica por el método de Klason. Se analizan los cambios de composición de la hemicelulosa y la celulosa cristalina.

La lignina Down-regulación de<em&gt; Zea mays</em&gt; Vía dsRNAi y Análisis de lignina Klason

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K vistas.  University of Arizona.  Una interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) técnica se emplea para regular a la baja la coenzima A reductasa cinamoilo maíz gen (ZmCCR1) a un menor contenido de lignina de la planta. La lignina regulación a la baja de la pared celular se visualiza mediante análisis microscópicos y se cuantifica por el método de Klason. Se analizan los cambios de composición de la hemicelulosa y la celulosa cristalina. 

Video: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

Ecografía de contraste dirigidos tratamiento de los gliomas en ratones a través de la entrega de nanopartículas de drogas y la ablación Teniendo microvascular

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Investigación

Bioingeniería

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

La cuantificación de la función diastólica por Global Análisis basado en Modelado cinemático de flujo transmitral mediante el formalismo de llenado diastólico parametrizada

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

El estudio de la materia y Soft-Sistemas Biológicos en un amplio Longitud escala del nanómetro y el micrómetro Tamaños en el pequeño ángulo de neutrones difractómetro KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos eléctricos y de campo magnético para la estimulación de tejidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&amp;#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Ingeniería de agentes antivirales a través de la resonancia de plasmones de superficie

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...