La función mitocondrial es fundamental para la homeostasis celular y la tasa de consumo de oxígeno es un indicador decisivo de la salud mitocondrial. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para analizar la tasa de consumo de oxígeno en C.elegans. Este protocolo hace uso de C.elegans móviles en vivo que proporcionan una medición legal de la función mitocondrial.
Elevar la necesidad de aislar las mitocondrias, un paso que potencialmente podría afectar su integridad. Para empezar, transfiera larvas L4 de fondos genéticos deseados a un césped recién sembrado de Escherichia coli en medios de crecimiento de nematodos o placas NGM. Utilice al menos dos placas de 100 mm o tres de 60 mm para cada cepa.
Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adecuada durante tres a cuatro días, o hasta que las placas se concentren con un gran número de huevos y gusanos gravídicos. Lave los huevos y gusanos de las placas con aproximadamente 6 mililitros de tampón M9 por cada placa de 100 milímetros de nematodos. Usando pipetas de pasto de vidrio, transfiera los huevos y gusanos a tubos individuales de centrífuga de 15 mililitros para cada cepa.
Gire estos tubos hacia abajo durante tres minutos a 6, 180 g. Después de la centrifugación, aspirar el tampón M9 conservando sólo el animal y el pellet de huevo. Agregue de tres a cuatro mililitros de solución de lejía a cada tubo y vórtice intermitentemente durante seis minutos.
Luego, agregue el tampón M9 para llenar cada tubo y gire a 6, 180 g durante un minuto. Aspirar el sobrenadante y repetir este lavado con el M9, tres veces. Después del lavado, mueva el pellet de huevo a un tubo fresco de 15 mililitros que contenga aproximadamente nueve mililitros de tampón M9.
Sincronice los gusanos recién eclosionados mediante la nuez a 20 grados centígrados durante 16 a 48 horas. Después de girar estos tubos a 6, 180 g durante 1,5 minutos, coloque los animales sincronizados L-1 en un césped recién sembrado de OP50 en placas NGM individuales. Mantenga las placas a 20 grados centígrados hasta que los animales lleguen a la etapa larval L-4 después de aproximadamente 42 horas.
En este momento, utilice una selección de platino para mover las larvas L4 a placas NGM de semillas OP50 que contienen 0,5 miligramos por mililitro de FUdR para evitar que produzca progenie. Hidratar el cartucho del sensor añadiendo 200 microlitros de agua destilada a cada pozo de la placa, asegurando que las sondas del sensor estén sumergidas. Guarde los platos durante la noche a temperatura ambiente.
Apague el elemento calefactor dentro de la interfaz del respirómetro. Almacenar la máquina dentro de una incubadora celsius de 15 grados reduce la temperatura del núcleo dentro de la máquina y evita que los animales se sobrecalienten durante el ensayo. Después de la incubación durante la noche, pipetear y desechar el agua destilada utilizada para hidratar las sondas del sensor, y reemplazarla con 200 microlitros de la solución calibradora en cada pozo.
Diluir la solución de material FCCP a 100 micromolarES FCCP en agua destilada. A continuación, añada 20 microlitros de la solución diluida al puerto de inyección A en el cartucho del sensor. Agregue 22 microlitros de 400 azidas de sodio milimolar al puerto de inyección B del cartucho del sensor.
Ahora, encienda el respirómetro. En la pantalla de inicio, seleccione inicio y aparecerán las páginas de plantilla. En la página de plantillas, seleccione blank"o una plantilla diseñada previamente.
Aparecerá la página de grupos. En la página de grupos, seleccione los pozos A y H como los pozos de fondo y asigne los seis pozos restantes en grupos apropiados de acuerdo con el plan experimental. Acceda a la página del protocolo haciendo clic en la flecha de la parte inferior derecha y asegúrese de que el botón equilibrado, basal y las inyecciones uno y dos están seleccionados.
Ajuste el número de lecturas de OCR basal, así como el OCR máximo y el OCR no mitocondrial. Seleccione la flecha en la esquina inferior derecha. Aparecerá un mensaje para cargar la placa del cartucho del sensor.
Asegúrese de que la placa del cartucho del sensor esté cargada en la orientación correcta, siguiendo las instrucciones de la pantalla del indicador de recordatorio. El respiraómetro ahora equilibrará el cartucho. Agregue 200 microlitros de tampón M9 en cada uno de los ocho pozos y depósitos circundantes de la placa celular.
Escoja aproximadamente 100 gusanos de cada cepa en placas NGM no sesedadas, y deje reposar durante dos a tres minutos. Luego, moja el extremo de la selección de platino con tampón M9 y elige animales sincronizados de 20 años en pozos B a G, dejando los pozos de fondo A y H vacíos. Ahora, haga clic en Aceptar en el software del respterómetro para expulsar la placa que contiene el búfer de calibración.
Retire la placa del respirómetro dejando el cartucho del sensor dentro del instrumento. Sustituya la placa calibrante por la placa que contiene los animales. Cargue las placas y cierre la puerta golpeando continuar y permitir que el ensayo funcione.
Una vez completada la ejecución del ensayo, siga las indicaciones de la pantalla para extraer la placa de celda y el cartucho del sensor. Inserte una unidad flash en el puerto USB para guardar el formato de guerra de datos de ejecución. Retire el cartucho del sensor y deje que los animales se asienten en el fondo de los pozos durante aproximadamente dos minutos.
Coloque las placas celulares bajo un microscopio de disección estéreo y cuente el número de animales por pozo. Abra el software de análisis, seguido de la pestaña de normalización, para normalizar las tasas de consumo de oxígeno al número de animal. Aplique los niveles adecuados para los distintos grupos en la pestaña modify", y exporte el archivo como un archivo prisma para su posterior análisis.
El promedio de las primeras cinco mediciones es el OCR basal. El promedio de las cinco mediciones después de la adición de FCCP es el OCR máximo. Por último, el promedio de las últimas cinco mediciones después de la adición de azida sódica es la tasa de respiración no mitocondrial.
Dado que la desregulación del calcio puede dar lugar a alteraciones en la función mitocondrial, se midieron ocr tanto en los mutantes sel-12 como en los animales de tipo salvaje para examinar el efecto de las mutaciones de sel-12 en la función y la salud mitocondriales. Los animales de tipo salvaje mostraron constantemente tasas basales de OCR por debajo de cinco picomoles por minuto, por gusano. Mientras que las tres cepas de mutantes sel-12 mostraron OCR significativamente elevado, de aproximadamente siete picomoles por minuto, por gusano.
Tras la adición de FCCP, hubo un aumento en el OCR de tipo salvaje, así como mutantes sel-12, como se esperaba. Los animales de tipo salvaje mostraron un OCR máximo de aproximadamente siete picomoles por minuto, por gusano. Mientras que los mutantes sel-12 tenían OCR de aproximadamente 10 picomoles por minuto, por gusano.
Utilice animales vivos, bien alimentados y asinzronizados en este ensayo, y evite la transferencia de huevos o cadáveres a pozos de ensayo. Además, la temperatura interna del instrumento no debe exceder los 25 grados centígrados. La lejía, el FCCP, el FUdR y el azida sódica son tóxicos.
Por lo tanto, se debe tener cuidado de usar guantes de protección durante la preparación de soluciones de stock y la carga de medicamentos.
