ミトコンドリア機能は細胞恒常性に重要であり、酸素消費率はミトコンドリアの健康の決定的な指標です。このプロトコルは、C.elegansの酸素消費量率を分析するための詳細な指示を提供します。このプロトコルは、ミトコンドリア機能の法的測定を提供するライブ、モバイルC.elegansを利用しています。
ミトコンドリアを分離する必要性を高める, 潜在的にそれが整合性に影響を与える可能性のあるステップ.まず、望ましい遺伝的背景のL4幼虫を、ネマトデ成長培地またはNGMプレート上の大腸菌の新種の芝生に移す。各株に少なくとも2つの100 mmまたは3つの60 mmプレートを使用してください。
3〜4日間、またはプレートが多数の卵とグラビッドワームで濃縮されるまで、適切な成長温度でワームをインキュベートします。卵とワームを、線虫の100ミリメートルプレートあたり約6ミリリットルのM9バッファーを使用してプレートから洗い流します。ガラスの牧草地のピペットを使用して、卵とワームを各株の個々の15ミリリットル遠心分離管に移します。
6、180gで3分間、3分間、本管を下ろします。遠心分離後、動物および卵ペレットのみを保持するM9緩衝液を吸引する。各チューブに3〜4ミリリットルの漂白剤溶液を加え、断続的に渦を6分間加えます。
次に、M9バッファーを加え、各チューブを充填し、1分間6、180gでスピンします。上清を吸引し、M9で3回この洗浄を繰り返します。洗浄後、約9ミリリットルのM9バッファーを含む新鮮な15ミリリットルのチューブに卵ペレットを移動します。
16〜48時間摂氏20度で、孵化したてのワームを同期させます。これらのチューブを6、180gで1.5分間回転させた後、同期したL-1動物をOP50の新しい播種された芝生の上に個々のNGMプレートに置きます。約42時間後に動物がL-4幼虫段階に達するまで、プレートを摂氏20度に保ちます。
このとき、プラチナピックを使用して、FUdRの1ミリリットル当たり0.5ミリグラムを含むOp50播種NGMプレートにL4幼虫を移動させ、子孫を産生するのを防ぎます。200マイクロリットルの蒸留水をプレートの各ウェルに加えてセンサーカートリッジを水和し、センサープローブが水没していることを確認します。プレートを室温で一晩保管します。
レスピロメーターインターフェース内の発熱体をオフにします。機械を15°Cのインキュベーターの中に保管すると、機械内のコア温度が下がり、アッセイ中に動物が過熱するのを防ぎます。一晩のインキュベーションの後、ピペットを取り出し、センサープローブを水和するために使用される蒸留水を捨て、各ウェル内の200マイクロリットルのキャリバーラント溶液に交換します。
蒸留水で100マイクロモルFCCPにFCCPストック溶液を希釈します。次に、希釈溶液の20マイクロリットルをセンサーカートリッジの注入ポートAに加える。センサーカートリッジの注入口Bに400ミリモルナトリウムアジドの22マイクロリットルを加えます。
さて、呼吸数計をオンにします。ホーム画面で[開始]を選択すると、テンプレートページが表示されます。テンプレートページで、空白」または以前にデザインされたテンプレートを選択します。
グループ ページが表示されます。グループページで、ウェルAとHをバックグラウンドウェルとして選択し、残りの6つの井戸を実験計画に従って適切なグループに割り当てます。右下の矢印をクリックしてプロトコルページにアクセスし、平衡、基底、および注入の1および2ボタンが選択されていることを確認します。
基礎OCRの読み取り値の数だけでなく、最大OCRと非ミトコンドリアOCRを調整します。右下隅の矢印を選択します。センサーカートリッジプレートをロードするように求めるプロンプトが表示されます。
リマインダープロンプト画面の指示に従って、センサーカートリッジプレートが正しい方向にロードされていることを確認します。レスピラメーターがカートリッジを平衡化します。8つのウェルとセルプレートの周囲の貯水池のそれぞれにM9バッファーの200マイクロリットルを追加します。
各株から約100個のワームをシードなしのNGMプレートに取り込み、2〜3分間休ませます。その後、M9バッファーでプラチナピックの端を濡らし、20歳の同期動物をGを通してウェルBに選び、バックグラウンドウェルAとHを空のままにします。ここで、ソフトウェアの「OK」をクリックして、キャリブレーションバッファを含むプレートを取り出します。
センサーカートリッジを器具の中に残して、レスピロメーターからプレートを取り外します。キャリブラントプレートを動物を含むプレートに交換します。プレートをロードし、続けて押してドアを閉め、アッセイを実行させます。
アッセイの実行が完了したら、画面の指示に従ってセルプレートとセンサーカートリッジを取り外します。USB ポートにフラッシュ ドライブを挿入して、実行データの戦争形式を保存します。センサーカートリッジを取り外し、動物が約2分間井戸の底に落ち着くようにします。
細胞板をステレオ解剖顕微鏡の下に置き、井戸当たりの動物数を数えます。分析ソフトウェアを開き、その後に正規化タブを開き、酸素消費率を動物数に正規化します。「変更」タブの下の様々なグループに適切なレベルを適用し、さらなる分析のためにプリズムファイルとしてファイルをエクスポートします。
最初の5つの測定の平均は基底OCRである。FCCPの付加の後の5つの測定の平均は最も大きいOCRである。最後に、アジドナトリウム添加後の最後の5回の測定値の平均は、非ミトコンドリア呼吸率である。
カルシウム調節不変性はミトコンドリア機能の変化をもたらす可能性があるため、sel-12変異体と野生型動物の両方でOCRを測定し、ミトコンドリア機能および健康に対するsel-12突然変異の影響を調べた。野生型動物は一貫してワームあたり毎分5ピコモール以下の基底OCR率を示した。セル-12突然変異体の3つの株はすべてOCRを有意に上昇させたが、1分間に約7ピコモールの、ワーム当たり。
FCCPの添加に際して、期待通りに野生型のOCR、ならびにsel-12変異体の増加があった。野生型動物は、ワームあたり1分間に約7ピコモールの最大OCRを示した。sel-12変異体は1分間に約10ピコモールのOCRを持っていたが、ワームあたり。
このアッセイでは、生きて、よく餌を与えられ、非同期の動物を使用し、アッセイ井戸への卵または死体の移動を避けてください。さらに、器械の内部温度は摂氏25度を超えてはなりません。漂白剤、FCCP、FUdR、およびアジドナトリウムは有毒です。
したがって、在庫液および薬物ローディングの準備中に保護手袋を着用するよう注意する必要があります。
