A função mitocondrial é fundamental para a homeostase celular e a taxa de consumo de oxigênio é um indicador decisivo da saúde mitocondrial. Este protocolo fornece instruções detalhadas para analisar a taxa de consumo de oxigênio em C.elegans. Este protocolo faz uso de C.elegans móveis ao vivo fornecendo uma medição legal da função mitocondrial.
Elevar a necessidade de isolar mitocôndrias, um passo que poderia potencialmente afetar sua integridade. Para começar, transfira larvas L4 de fundos genéticos desejados para um gramado recém-semeado de Escherichia coli em mídia de crescimento de nematoides ou placas de NGM. Use pelo menos duas placas de 100 mm ou três de 60 mm para cada cepa.
Incubar os vermes na temperatura de crescimento apropriada por três a quatro dias, ou até que as placas estejam concentradas com um grande número de ovos e vermes gravid. Lave os ovos e vermes das placas usando aproximadamente 6 mililitros de tampão M9 por placa de 100 milímetros de nematoides. Usando pipetas de pastagem de vidro, transfira os ovos e vermes em tubos individuais de centrífugas de 15 mililitros para cada cepa.
Gire os tubos de teses por três minutos a 6.180 g. Após a centrifugação, aspire o tampão M9 retendo apenas a pelota animal e ovo. Adicione três a quatro mililitros de solução alvejante a cada tubo e vórtice intermitente por seis minutos.
Em seguida, adicione o tampão M9 para encher cada tubo e gire a 6,180 g por um minuto. Aspire o supernaspe e repita esta lavagem com o M9, três vezes. Após a lavagem, mova a pelota de ovo para um tubo fresco de 15 mililitros contendo aproximadamente nove mililitros de tampão M9.
Sincronize os vermes recém-eclodidos por nozes a 20 graus Celsius por 16 a 48 horas. Depois de girar esses tubos para baixo a 6, 180 g por 1,5 minutos, coloque os animais L-1 sincronizados em um gramado recém-semeado de OP50 em placas individuais de NGM. Mantenha as placas a 20 graus Celsius até que os animais atinjam o estágio larval L-4 após aproximadamente 42 horas.
Neste momento, use uma picareta de platina para mover as larvas L4 para placas de GNM semeadas OP50 contendo 0,5 miligramas por mililitro de FUdR para evitar que a produção prole produza. Hidrate o cartucho do sensor adicionando 200 microliters de água destilada a cada poço na placa, garantindo que as sondas do sensor estejam submersas. Armazene as placas durante a noite em temperatura ambiente.
Desligue o elemento de aquecimento dentro da interface do respirômetro. Armazenar a máquina dentro de uma incubadora de 15 graus Celsius reduz a temperatura do núcleo dentro da máquina e evita que os animais superaqueçam durante o ensaio. Após a incubação durante a noite, pipeta para fora e descartar a água destilada usada para hidratar as sondas do sensor, e substituí-la por 200 microliters da solução calibrante em cada poço.
Diluir a solução de estoque da FCCP para 100 FCCP micromolar em água destilada. Em seguida, adicione 20 microliters da solução diluída à porta de injeção A no cartucho do sensor. Adicione 22 microliters de 400 mililitros de sódio azides à porta de injeção B do cartucho do sensor.
Agora, ligue o respirômetro. Na tela inicial, selecione iniciar e as páginas de modelo aparecerão. Na página de modelos, selecione em branco" ou um modelo previamente projetado.
A página dos grupos aparecerá. Na página dos grupos, selecione os poços A e H como poços de fundo e atribua os seis poços restantes em grupos apropriados de acordo com o plano experimental. Acesse a página do protocolo clicando na seta no lado inferior direito e certifique-se de que o botão equilíbrio, basal e injeções um e dois sejam selecionados.
Ajuste o número de leituras do OCR basal, bem como o OCR máximo e o OCR não mitocondrial. Selecione a seta no canto inferior direito. Uma solicitação para carregar a placa do cartucho do sensor aparecerá.
Certifique-se de que a placa do cartucho do sensor esteja carregada na orientação correta, seguindo as instruções na tela rápida do lembrete. O respirador agora equilibrará o cartucho. Adicione 200 microliters de tampão M9 em cada um dos oito poços e reservatórios circundantes da placa celular.
Escolha aproximadamente 100 vermes de cada cepa em placas de NGM não semeadas e deixe descansar por dois a três minutos. Em seguida, molhe a extremidade da picape de platina com tampão M9 e escolha animais sincronizados de 20 anos em poços de B a G, deixando os poços de fundo A e H vazios. Agora, clique em OK no software respirômetro para ejetar a placa contendo buffer de calibração.
Remova a placa do respirômetro deixando o cartucho do sensor dentro do instrumento. Substitua a placa calibrante pela placa que contém os animais. Carregar placas e fechar a porta batendo continue e deixe o ensaio funcionar.
Uma vez que a execução do ensaio esteja completa, siga as instruções na tela para remover a placa celular e o cartucho do sensor. Insira uma unidade flash na porta USB para salvar o formato de guerra de dados de execução. Remova o cartucho do sensor e deixe que os animais se acomodem na parte inferior dos poços por aproximadamente dois minutos.
Coloque as placas de célula sob um microscópio de dissecação estéreo e conte o número de animais por poço. Abra o software de análise, seguido da guia de normalização, para normalizar as taxas de consumo de oxigênio para o número animal. Aplique níveis apropriados para os vários grupos sob a guia modificação e exporte o arquivo como um arquivo prisma para análise posterior.
A média das cinco primeiras medições é o OCR basal. A média das cinco medidas após a adição do FCCP é o OCR máximo. Finalmente, a média das últimas cinco medidas após a adição de azida de sódio é a taxa de respiração não mitocondrial.
Uma vez que a desregulação do cálcio pode resultar em uma função mitocondrial alterada, o OCR tanto nos mutantes sel-12 quanto em animais do tipo selvagem foram medidos para examinar o efeito das mutações sel-12 na função mitocondrial e na saúde. Animais do tipo selvagem apresentaram consistentemente taxas basais de OCR abaixo de cinco picomoles por minuto, por verme. Enquanto todas as três cepas de mutantes sel-12 mostraram OCR significativamente elevado, de aproximadamente sete picomoles por minuto, por verme.
Após a adição da FCCP, houve um aumento no OCR do tipo selvagem, bem como mutantes sel-12, como esperado. Animais do tipo selvagem apresentaram OCR máximo de aproximadamente sete picomoles por minuto, por verme. Enquanto os mutantes sel-12 tinham OCR de aproximadamente 10 picomoles por minuto, por verme.
Use animais vivos, bem alimentados e assincronizados neste ensaio, e evite a transferência de ovos ou carcaças em poços de ensaio. Além disso, a temperatura interna do instrumento não deve exceder 25 graus Celsius. Alvejante, FCCP, FUdR e azida de sódio são tóxicos.
Portanto, deve-se tomar cuidado para usar luvas de proteção durante a preparação de soluções de estoque e carregamento de drogas.
