Esta técnica permite no sólo la localización, sino también la cuantificación de los MRNas candidatos en los ovocitos y embriones individuales. En comparación con otros ensayos, incluido el PCR, la finalización de la técnica da como resultado datos reproducibles con baja variación. Demostrando el procedimiento estará Kelsey Timme, un estudiante graduado en mi laboratorio.
Comience este procedimiento con la preparación del material requerido y ratones hembra a las cinco a ocho semanas de edad como se describe en el protocolo de texto. Limpie el ratón con 70% de etanol. Exponer la cavidad abdominal y visualizar el tracto reproductivo femenino.
Sostenga el ovario con fórceps y retire los ligamentos uterinos y el exceso de tejido adiposo de alrededor del ovario. Corta el oviducto del útero. A continuación, coloque el par de oviductos de ovario en un medio de retención caliente en un plato de 35 milímetros.
Retire el ovario y cualquier tejido adiposo circundante. Rasgue la ampolla hinchada del oviducto con una aguja de calibre 27 de media pulgada. Empuje el oviducto en el sitio de los complejos de lágrimas y ócitos de células cúmulos serán expulsados.
Usar una pipeta bucal para transferir los ovocitos ovulados a la gota de 100 microlitros que contiene el medio de retención con hialuronidasa. Para desalojar las células cúmulos, pipetee la metafase dos complejos de células cúmulos de ovocitos arriba y abajo en la hialuronidasa que contiene el medio de retención con la pipeta de la boca. Una vez que estén desprovistas de células cúmulos, utilice la pipeta bucal para transferir cada óocitos a una gota de lavado que contenga sólo el medio de retención.
Repita esto para cada gota de lavado. No transfiera ovocitos fragmentados o transparentes. Para realizar la tinción SM-FISH, primero fije los ovocitos en un pozo individual de una placa de seis pozos que contenga 500 microlitros de tampón de fijación.
Sumergir 20 ovocitos o menos en el pozo. Incubar los ovocitos en tampón de fijación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar los ovocitos como se describe en el protocolo de texto, incubar ovocitos en tampón de permeabliización durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de otro lavado, transfiera los ovocitos a 80 microlitros de proteasa pre-diluida tres tampón durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diluir los conjuntos de sondeos calentados para Nanog, Pou5f1 y DapB de uno a 50 en diluyente de sonda. Incubar ovocitos en 80 microlitros de la sonda de transcripción específica durante dos horas a 40 grados centígrados.
Cuando los ovocitos están en la sonda y los búferes AMP, tienden a flotar. Es esencial que sumerja los ovocitos empujándolos suavemente en el tampón. Transfiera los ovocitos a 500 microlitros de tampón de lavado e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Ahora, incubar ovocitos secuencialmente en tampones de amplificación. En primer lugar, incubar ovocitos en 80 microlitros de AMP1 durante 30 minutos a 40 grados centígrados. A continuación, transfiera los ovocitos a 500 microlitros de tampón de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, incubar ovocitos en 80 microlitros de AMP2 durante 15 minutos a 40 grados centígrados. Después de lavar los ovocitos como antes, incubar los ovocitos en 80 microlitros de AMP3 durante 30 minutos a 40 grados centígrados seguidos de un lavado final. Por último, añada ovocitos a 80 microlitros de AMP4FL durante 15 minutos a 40 grados centígrados.
Pipetear 12 microlitros de medio de montaje anti-fade en el centro de un portaobjetos sin añadir burbujas al reactivo. Transfiera ovocitos con el menor tampón de lavado posible al medio de montaje. Por último, aplique un recibo de cubierta.
Imagine los ovocitos tridimensionales utilizando la microscopía confocal del paso Z y guarde las imágenes como se describe en el protocolo de texto. Arrastre archivos ND2 a Fiji y elija Hyperstack. Haga clic en la pestaña Imagen, seleccione Color y haga clic en Dividir canales para separar los canales fluorescentes del archivo ND2.
Genere archivos TIFF individuales para cada segmento Z de los ovocitos en cada canal fluorescente. Para ello, haga clic en la pestaña Imagen, seleccione Pilas y haga clic en Apilar en imágenes. A continuación, haga clic en la pestaña Imagen, seleccione Tipo y haga clic en Color RGB para convertir cada sector Z en una imagen de color RGB individual.
Guarde cada imagen convertida como un archivo TIFF. Coloque imágenes de un único óocitos para cada canal fluorescente en una nueva carpeta para evitar confusiones durante la costura. Después de normalizar los archivos como se describe en el protocolo de texto, haga clic en la pestaña Plugins, seleccione Puntada y haga clic en Colección de cuadrículas.
Seleccione Imágenes secuenciales en el menú desplegable y haga clic en Aceptar. Examine el directorio y seleccione la carpeta que contiene todas las imágenes del sector Z para un ócito individual en una longitud de onda. Haga clic en Aceptar.
Mueva el control deslizante en la parte inferior de la imagen cosida al canal de color adecuado para la longitud de onda utilizada. Cree la imagen cosida RGB final haciendo clic en Imagen, seleccionando Tipo y haciendo clic en Color RGB. Convierta la imagen cosida en una imagen proyectada máxima de 32 bits.
Para ello, haga clic en Imagen, seleccione Tipo y haga clic en 32 bits. Guarde esta imagen como un nuevo archivo TIFF. Abra la imagen cosida de 32 bits en un programa de búsqueda y seguimiento puntual.
Seleccione el menú desplegable Localizar y haga clic en Localizar, que calculará el número de puntos encontrados en la imagen. Aquí se muestra la cuantificación de los mRNAs utilizando el buscador de puntos y el seguimiento. La flecha azul apunta a una señal positiva por encima del umbral.
La flecha blanca muestra un punto fluorescente por debajo del umbral y, por lo tanto, no se cuenta. Los recuentos de ARNm se analizaron posteriormente utilizando una herramienta de análisis de datos estándar. Las imágenes representativas de la imagen de la serie Z central se muestran para Pouf51 y Nanog.
La tinción DAPI de cromosomas alineados en la metafase dos husillos se muestra en blanco. Los datos recogidos en este protocolo mostraron 775 transcripciones de Puuf51 y 113 transcripciones de Nanog en metafase dos ovocitos. Es importante destacar que no se detectaron manchas en los ovocitos etiquetados con la sonda DapB, que sirvió como control negativo.
Cuando se utilizan células no adherentes, es importante identificar empíricamente la mejor dilución del tampón de proteasa del kit SM-FISH. La detección de ARNm se probó utilizando una curva de valoración de concentraciones de tampón de proteasa no diluida y varias concentraciones diluidas de tampón de proteasa en 1xPBS. La dilución de proteasa utilizada en este protocolo fue de uno a ocho, ya que mostró la variación más baja en la expresión fluorescente promedio de Puuf51 mRNA en dos ovocitos metafásicas.
La inmunofluorescencia simultánea de una proteína diana se puede realizar para co-localizar el ARNm con una proteína de unión al ARN. La co-localización de los ARNm con las proteínas de unión al ARN permite a los investigadores determinar los mecanismos que regulan el almacenamiento, la traducción y la degradación del ARNm dentro de un óocitos o embrión.
