Diese Technik ermöglicht nicht nur die Lokalisierung, sondern auch die Quantifizierung von Kandidaten-mRNAs in den einzelnen Eizellen und Embryonen. Im Vergleich zu anderen Assays, einschließlich PCR, führt die Vervollständigung der Technik zu reproduzierbaren Daten mit geringer Variation. Demonstriert wird das Verfahren von Kelsey Timme, einem Doktoranden in meinem Labor.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung des benötigten Materials und weiblicher Mäuse im Alter von fünf bis acht Wochen, wie im Textprotokoll beschrieben. Reinigen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Setzen Sie die Bauchhöhle aus und visualisieren Sie den weiblichen Fortpflanzungstrakt.
Halten Sie den Eierstock mit Zangen und entfernen Sie die Gebärmutterbänder und überschüssiges Fettgewebe aus der Umgebung des Eierstocks. Schneiden Sie das Eileiteraus der Gebärmutter. Dann legen Sie das Ovarialoviktspaar in einem warmen Haltemedium in eine 35-Millimeter-Schale.
Entfernen Sie den Eierstock und alle umgebenden Fettgewebe. Reißen Sie die geschwollenen Ampullen des Eileiters mit einer halben Zoll 27 Gauge Nadel. Drücken Sie das Eileiter an der Stelle der Tränen- und Cumuluszell-Oozytenkomplexe werden vertrieben.
Mit einer Mundpipette, um die eigeovten Eizellen auf den 100-Mikroliter-Tropfen zu übertragen, der das Haltemedium mit Hyaluronidase enthält. Um Cumuluszellen zu vertreiben, pipette die Metaphase zwei Oozyten-Cumulus-Zell-Komplexe nach oben und unten in der Hyaluronidase enthaltendes Haltemittel mit der Mundpipette. Sobald sie frei von Cumuluszellen sind, verwenden Sie die Mundpipette, um jede Eizelle auf einen Waschtropfen zu übertragen, der nur haltemittel enthält.
Wiederholen Sie dies für jedes Waschtropfen. Übertragen Sie keine fragmentierten oder transparenten Eizellen. Um SM-FISH Färbung durchzuführen, fixieren Sie zuerst Eizellen in einem einzelnen Brunnen einer sechs Brunnenplatte, die 500 Mikroliter Fixationspuffer enthält.
Tauchen Sie 20 Eizellen oder weniger in den Brunnen. Inkubieren Sie die Eizellen im Fixationspuffer 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Eizellen, wie im Textprotokoll beschrieben, inkubieren Eizellen in Permeablization Puffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Nach einer weiteren Wäsche die Eizellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf 80 Mikroliter vorverdünnter Protease-Dreipuffer übertragen. Verdünnen Sie die erwärmten Sondensätze für Nanog, Pou5f1 und DapB einbis 50 in Sondenverdünnungsstoff. Oozyten in 80 Mikroliter der Transkript-spezifischen Sonde für zwei Stunden bei 40 Grad Celsius inkubieren.
Wenn sich Eizellen in der Sonde und den AMP-Puffern befinden, neigen sie dazu, zu schweben. Es ist wichtig, dass Sie die Eizellen untertauchen, indem Sie sie sanft in den Puffer schieben. Die Eizellen auf 500 Mikroliter Waschpuffer übertragen und 10 Minuten bei Raumtemperatur brüten.
Inkubieren Sie nun Oozyten sequenziell in Amplifikationspuffern. Zuerst inkubieren Eizellen in 80 Mikroliter VON AMP1 für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius. Dann die Eizellen auf 500 Mikroliter Waschpuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur übertragen.
Als nächstes inkubieren Eizellen in 80 Mikroliter VON AMP2 für 15 Minuten bei 40 Grad Celsius. Nach dem Waschen der Eizellen wie zuvor, inkubieren Sie die Eizellen in 80 Mikroliter VON AMP3 für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius, gefolgt von einer letzten Wäsche. Zum Schluss oozyten zu 80 Mikroliter n. AMP4FL für 15 Minuten bei 40 Grad Celsius hinzufügen.
Pipette 12 Mikroliter Anti-Fade-Montagemedium auf die Mitte eines Dias ohne Zugabe von Blasen zum Reagenz. Eizellen mit möglichst wenig Waschpuffer in das Montagemedium übertragen. Wenden Sie schließlich einen Deckbedeckungszettel an.
Stellen Sie die dreidimensionalen Eizellen mit der Konfokalmikroskopie des Z-Schritts ab und speichern Sie die Bilder, wie im Textprotokoll beschrieben. Ziehen Sie ND2-Dateien nach Fidschi und wählen Sie Hyperstack. Klicken Sie auf die Registerkarte Bild, wählen Sie Farbe aus, und klicken Sie auf Kanäle teilen, um die fluoreszierenden Kanäle der ND2-Datei zu trennen.
Generieren Sie einzelne TIFF-Dateien für jedes Z-Slice der Eizellen in jedem Fluoreszenzkanal. Klicken Sie dazu auf die Registerkarte Bild, wählen Sie Stapel aus, und klicken Sie auf Stapel na Bild. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Bild, wählen Sie Typ aus, und klicken Sie auf RGB-Farbe, um jedes Z-Slice in ein einzelnes RGB-Farbbild zu konvertieren.
Speichern Sie jedes konvertierte Bild als TIFF-Datei. Platzieren Sie Bilder aus einer einzelnen Oozyte für jeden fluoreszierenden Kanal in einem neuen Ordner, um Verwirrung beim Nähen zu vermeiden. Nachdem Sie die Dateien wie im Textprotokoll beschrieben normalisiert haben, klicken Sie auf die Registerkarte Plugins, wählen Stitching aus, und klicken Sie auf Grid Collection.
Wählen Sie Sequenzielle Bilder aus dem Dropdown-Menü und klicken Sie auf Okay. Durchsuchen Sie das Verzeichnis, und wählen Sie den Ordner aus, der alle Z-Slice-Bilder für eine einzelne Oozyte bei einer Wellenlänge enthält. Klicken Sie auf Okay.
Verschieben Sie den Schieberegler am unteren Rand des genähten Bildes auf den entsprechenden Farbkanal für die verwendete Wellenlänge. Erstellen Sie das endgültige RGB-genähte Bild, indem Sie auf Bild klicken, Typ auswählen und auf RGB-Farbe klicken. Konvertieren Sie das genähte Bild in ein maximal 32-Bit-Bild.
Klicken Sie dazu auf Bild, wählen Sie Typ aus, und klicken Sie auf 32-Bit. Speichern Sie dieses Bild als neue TIFF-Datei. Öffnen Sie das 32-Bit-Stitch-Bild in einem Spot-Find- und Tracking-Programm.
Wählen Sie die Dropdown-Liste Lokalisieren aus, und klicken Sie auf Lokalisieren, wodurch die Anzahl der im Bild gefundenen Punkte berechnet wird. Hier ist die Quantifizierung von mRNAs mit dem Spotfinder und Tracking zu sehen. Der blaue Pfeil zeigt auf ein positives Signal oberhalb der Schwelle.
Der weiße Pfeil zeigt einen fluoreszierenden Punkt unterhalb der Schwelle und wird daher nicht gezählt. Die mRNA-Zählungen wurden anschließend mit einem Standard-Datenanalyse-Tool analysiert. Repräsentative Bilder des Bildes der mittleren Z-Serie werden für Pouf51 und Nanog gezeigt.
Die DAPI-Färbung von Chromosomen, die auf der Metaphase zwei Spindel ausgerichtet sind, ist weiß dargestellt. Die in diesem Protokoll gesammelten Daten zeigten 775 Pouf51-Transkripte und 113 Nanog-Transkripte in Metaphase zwei Oozyten. Wichtig ist, dass in Eizellen, die mit der DapB-Sonde beschriftet sind, keine Flecken entdeckt wurden, die als Negativkontrolle dienten.
Bei der Verwendung nicht-anhaftender Zellen ist es wichtig, empirisch die beste Verdünnung des Proteasepuffers aus dem SM-FISH-Kit zu identifizieren. Der mRNA-Nachweis wurde mit einer Titrationskurve von unverdünnten und mehreren verdünnten Proteasepufferkonzentrationen in 1xPBS getestet. Die in diesem Protokoll verwendete Protease-Verdünnung war eins bis acht, da sie die geringste Variation in der durchschnittlichen fluoreszierenden Expression von Pouf51 mRNA in Metaphase zwei Oozyten zeigte.
Die gleichzeitige Immunfluoreszenz eines Zielproteins kann durchgeführt werden, um die mRNA mit einem RNA-bindenden Protein zu lokalisieren. Die Kolokalisierung der mRNAs mit den RNA-bindenden Proteinen ermöglicht es den Forschern, Mechanismen zu bestimmen, die die speicherung, Translation und Degradation von mRNA innerhalb einer Oozyte oder eines Embryos regulieren.
