这种技术不仅允许定位，而且允许在单个卵母细胞和胚胎中对候选mRNA进行定量。与其他检测（包括 PCR）相比，该技术的完成可产生低变异的可重复数据。演示这个程序的将是凯尔西·提姆，一个研究生在我的实验室。
从编写所需的材料和五至八周大的雌性小鼠开始，如文本协议所述。使用 70% 乙醇清洁鼠标。暴露腹腔，想象女性生殖道。
用钳子握住卵巢，从卵巢周围取出子宫韧带和多余的脂肪组织。切开子宫的卵巢。然后，将卵巢卵巢对放在35毫米的培养皿中，放在温暖的保持介质中。
取出卵巢和周围的任何脂肪组织。用半英寸27针撕开卵巢的肿胀的安培。在撕裂和积积细胞卵母细胞复合物的位点推开卵巢将被驱逐。
使用口移液器将排卵卵母细胞转移到含有含海龙酶的持有介质的100微升滴中。为了转移积液细胞，移液器的元相两个卵母细胞积液细胞复合物在含有持有介质的 hyaluronidase 中上下与口移液器。一旦它们没有积液细胞，使用口腔移液器将每个卵母细胞转移到含有仅持有介质的洗涤液滴中。
对每个洗涤液滴重复此数。不要转移支离破碎或透明的卵母细胞。要进行 SM-FISH 染色，请先在包含 500 微升固定缓冲液的六井板的单个井中固定卵母细胞。
将20个卵母细胞淹没在井中。在室温下在固定缓冲液中孵育卵母细胞20分钟。如文本协议所述，洗涤卵母细胞后，在室温下在渗透缓冲液中孵育卵母细胞30分钟。
再次洗涤后，将卵母细胞转移到80微升的预稀释蛋白酶三缓冲液，在室温下30分钟。在探针稀释剂中稀释 Nanog、Pou5f1 和 DapB 的加热探测集 1 到 50。在80微升的转录器中孵育卵母细胞，特异性探针在40摄氏度下孵育两小时。
当卵母细胞在探针和 AMP 缓冲器中时，它们往往会浮。至关重要的是，你通过轻轻地将卵母细胞推入缓冲液来淹没卵母细胞。将卵母细胞转移到500微升的洗涤缓冲液，并在室温下孵育10分钟。
现在，在扩增缓冲液中按顺序孵育卵母细胞。首先，在80微升AMP1中孵育卵母细胞，在40摄氏度下孵育30分钟。然后在室温下将卵母细胞转移到500微升洗涤缓冲液10分钟。
接下来，在80微升AMP2中孵育卵母细胞，在40摄氏度下孵育15分钟。洗完卵母细胞后，在AMP3的80微升中孵育卵母细胞，在40摄氏度下孵育30分钟，然后进行最后清洗。最后，在40摄氏度下将卵母细胞加入80微升的AMP4FL中，15分钟。
将 12 微升防褪色安装介质移入幻灯片中心，无需向试剂添加气泡。将母细胞用尽可能少的洗涤缓冲液转移到安装介质中。最后，应用盖单。
使用 Z 步对共体显微镜对三维卵母细胞进行图像成像，并保存文本协议中描述的图像。将 ND2 文件拖动到斐济并选择超堆栈。单击"图像"选项卡，选择"颜色"，然后单击"拆分通道"以分隔 ND2 文件的荧光通道。
为每个荧光通道中卵母细胞的每个 Z 切片生成单独的 TIFF 文件。为此，请单击"图像"选项卡，选择"堆栈"，然后单击"堆叠到图像"。然后，单击"图像"选项卡，选择"类型"，然后单击 RGB 颜色将每个 Z 切片转换为单独的 RGB 颜色图像。
将每个转换的图像另存为 TIFF 文件。将每个荧光通道的单个卵母细胞的图像放在新文件夹中，以避免在缝合过程中出现混淆。按文本协议中所述对文件进行规范化后，单击"插件"选项卡，选择"拼接"，然后单击网格集合。
从下拉菜单中选择"顺序图像"，然后单击"确定"。浏览目录并选择包含单个卵母细胞在一个波长上的所有 Z 切片图像的文件夹。单击"确定"。
将拼接图像底部的滑块移动到使用波长的适当颜色通道。通过单击"图像"、选择"类型"和"单击 RGB 颜色"，创建最终的 RGB 拼接图像。将拼接的图像转换为 32 位最大投影图片。
为此，请单击"图像"，选择"类型"，然后单击 32 位。将此图像另存为新的 TIFF 文件。在现场查找和跟踪程序中打开 32 位拼接图像。
选择"本地化"下拉列表并单击"本地化"，这将计算图像中发现的点数。此处显示的是使用现场查找和跟踪的 mRNA 的量化。蓝色箭头指向阈值以上的正信号。
白色箭头显示阈值以下的荧光点，因此不计算。随后使用标准数据分析工具对mRNA计数进行了分析。中间 Z 系列图像的代表性图像显示为 Pouf51 和 Nanog。
在元相两个主轴上对齐的染色体的DAPI染色以白色显示。该协议收集的数据显示，775个Pouf51转录和113个纳米转录本在元相两个卵母细胞。重要的是，在标有DapB探针的卵母细胞中未检测到任何斑点，这些斑点充当负对。
当使用非粘附细胞时，重要的是从SM-FISH试剂盒中经验确定蛋白酶缓冲液的最佳稀释。mRNA检测使用1xPBS中未稀释和几种稀释蛋白酶缓冲液浓度的滴定曲线进行测试。本协议中使用的蛋白酶稀释为1至8，因为它显示了元相两个卵母细胞中Pouf51 mRNA平均荧光表达的最低变异。
可执行靶蛋白的并发免疫荧光，以便将mRNA与RNA结合蛋白共同定位。mRNA与RNA结合蛋白的共同定位使研究人员能够确定调节卵母细胞或胚胎内mRNA储存、转化和降解的机制。
